[发明专利]一种特定HBV序列插入到特定基因区域的细胞模型及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种将特定HBV序列插入到特定基因组区域的细胞模型的构建方法，其特征在于步骤如下：构建用以切割Chr5:1295920位置的gRNA与Cas9二合一质粒，其含有序列3所示的DNA片段，利用CRISPR/Cas9方法实现所述Chr5:1295920位置发生切割，形成DNA双链断裂；同时将含有Chr5:1295920目标位点上下游同源臂以及HBV的P序列的载体导入所述HEPG2细胞中，实现HBV的P序列定点整合到HEPG2细胞的Chr5:1295920位置区域；所述载体的序列如序列1所示，所述gRNA的靶序列如序列2所示。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：将同时表达所述靶向目标位置Chr5:1295920区域的gRNA与Cas9二合一质粒载体和序列1所示的载体导入所述HEPG2细胞中；所述gRNA与Cas9二合一质粒载体中还含有puro抗性基因。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

a构建用以切割Chr5:1295920位置的gRNA与Cas9二合一质粒载体；

b构建含有Chr5:1295920目标位点上下游同源臂的HBV基因组特定P序列DNA的载体，所述载体为序列1所示；

c获得P序列定点整合HEPG2细胞模型：

采取基于CRISPR/Cas9的基因打靶技术在HEPG2细胞中进行特异性切割Chr5:1295920目标位点，并利用细胞DNA的同源重组修复方式定点插入HBV基因组的P序列；

c1：培养HEPG2细胞系；

c2：将处于对数期增殖的HEPG2细胞，PBS清洗一次，消化3-5分钟后，轻轻吹打成单细胞；

c3：将步骤c2得到的5×10⁵个HEPG2单细胞，接种于6孔板培养板中；

c4：待HEPG2细胞培养至细胞密度为80％-85％，将步骤a和b构建的载体进行细胞转染；

c5：转染72h后，培养基中加入puro，进行筛选培养5天；筛选存活的多克隆细胞中可能存在P序列定点整合的HEPG2细胞系；

c6:药筛后存活的细胞系利用PBS清洗一次，消化3-5分钟后，轻轻吹打成单细胞，进行细胞计数，按照每孔1个细胞将细胞悬液接种于96孔细胞培养板；

c7：待7-10天后，培养板中长出新的克隆，将单克隆进行扩大培养进行P序列定点整合HEPG2细胞系的鉴定，获得P序列定点整合HEPG2细胞系。

4.权利要求1-3任一制备方法获得的细胞模型。

5.权利要求4所述的细胞模型在下述Y1-Y4中的任一应用：

Y1：在作为HBV基因片段定点整合细胞模型的应用；

Y2：在作为HBV病毒特定基因片段转录细胞模型中的应用；

Y3：在筛选抑制整合的HBV病毒转录的药物中的应用；

Y4：在确定HBV整合序列空间调控研究中的应用。