[发明专利]一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法

说明书

本发明公开了一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法，包括消毒处理分割、消化、筛滤、离心、纯化和培养；本发明提供的成年牦牛肌内前体脂肪细胞培养方法，不仅能够节省人力物力，还打破了传统培养方法使用初生牛犊脂肪组织和原代细胞高污染率的局限，使样品来源途径更加广泛，并能同时获取大量细胞，是一种便捷，高效的前体脂肪细胞培养方法，为后续深入研究肌内前体脂肪细胞增殖分化过程基因、蛋白表达、信号通路等提供分子基础，为研究不同部位脂肪沉积、脂肪代谢和脂肪动员等提供新思路和新方法，对改善牦牛肉质品质具有重要意义。

技术领域

本发明属于细胞工程和组织工程领域，具体涉及一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法。

背景技术

牦牛是中国特色牛种，能够适应高原地区严酷的自然环境，并且牦牛经济价值高，是当地牧民赖以生存的重要生活、生产资料。脂肪组织主要分布于四个部位：内脏、皮下、肌内、肌间，探究各部位脂肪组织的积累规律，对改善牦牛肉质品质具有重要意义，对进一步提高当地牧民经济收入具有重要的意义。然而，牦牛饲养方式落后，大多采取传统放牧的生产方式。虽然近年来研究证明牦牛在低海拔地区生长情况良好，但牦牛饲养育肥技术较其它牛种差距很大，并且肉牛肌肉间脂肪的沉积对生产高档牛肉“雪花牛肉”尤为重要，因此研究牦牛肌内前体脂肪细胞培养技术可以为从细胞分子水平探究牦牛肌内脂肪代谢过程提供理论支持，对牦牛阶段育肥体系的建立也具有重要意义。

当前牦牛肌内前体脂肪细胞体外培养技术未见有报道和研究，并且其他成年动物肌内前脂肪细胞分离技术普遍存在低活性和高污染率的问题，为解决前一问题，大多采样对象为幼龄动物，但高污染仍是原代细胞培养实验的重大问题，未见有效的解决办法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法，该突破了采样动物必须为幼龄动物的局限，极大降低了细胞污染率，而且还能收获大量高活性的脂肪细胞。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法，它包括以下步骤：

S1. 消毒处理：无菌条件下分离成年牦牛背最长肌组织，PBS冲洗表面至无污垢在碘酒中浸泡8-15min，然后迅速取出剥去外层染色区域组织；

S2. 分割：将消毒处理后的组织用PBS涮洗干净后分割呈小块，放入装有PBS的离心管中并剪成组织块；

S3. 消化：向含有组织块的离心管中加入消化酶溶液，37℃恒温消化100-150min，得消化液；其中，所述的消化酶溶液为I型胶原酶、II型胶原酶、BAS和氯化钙的D-hanks溶液；

S4. 筛滤：得到的消化液用40μm的无菌细胞筛过滤，收集滤液加终止培养基终止消化；其中，所述终止培养基为高糖培养基与FBS的混合液；

S5. 离心：将终止消化后的滤液1200rpm离心4-8min，弃去上清液得到细胞团；将细胞团用无血清高糖培养基洗涤两次，第一次洗涤离心机的转速为1000rpm离心4-8min，第二次洗涤离心机的转速800rpm离心4-8min；

S6. 纯化：离心后的细胞重悬于I型培养基，所述I型培养基为含有12% FBS、2%青/链霉素/两性霉素和2%L-谷氨酰胺的高糖培养基，通过差速贴壁纯化细胞；

S7. 培养：将纯化后的细胞在培养箱中培养，培养2d换一次I型培养基，之后每2d更换一次II型培养基，所述II型培养基为含有10% FBS、1%青/链霉素和2% L-谷氨酰胺的高糖培养基，待细胞汇合度达到95%后进行分化。

进一步地，步骤S2中所述组织块的大小为1-2mm³。

进一步地，步骤S3中消化酶溶液与组织块的体积比为2.5-4:1。