[发明专利]一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法

权利要求书

1.一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法，其特征在于，它包括以下步骤：

S1. 消毒处理：无菌条件下分离成年牦牛背最长肌组织，PBS冲洗表面至无污垢在碘酒中浸泡8-15min，然后迅速取出剥去外层染色区域组织；

S2. 分割：将消毒处理后的组织用PBS涮洗干净后分割呈小块，放入装有PBS的离心管中并剪成组织块；

S3. 消化：向含有组织块的离心管中加入消化酶溶液，37℃恒温消化100-150min，得消化液；其中，所述的消化酶溶液为100mg I型胶原酶、50mg II型胶原酶、1g BSA和5mol/L氯化钙的50 mL D-hanks溶液；

S4. 筛滤：得到的消化液用40μm的无菌细胞筛过滤，收集滤液加终止培养基终止消化；其中，所述终止培养基为高糖培养基与FBS的混合液；

S5. 离心：将终止消化后的滤液1200rpm离心4-8min，弃去上清液得到细胞团；将细胞团用无血清高糖培养基洗涤两次，第一次洗涤离心机的转速为1000rpm离心4-8min，第二次洗涤离心机的转速800rpm离心4-8min；

S6. 纯化：离心后的细胞重悬于I型培养基，所述I型培养基为含有12% FBS、2%青/链霉素/两性霉素和2%L-谷氨酰胺的高糖培养基，通过差速贴壁纯化细胞；

S7. 培养：将纯化后的细胞在培养箱中培养，培养2d换一次I型培养基，之后每2d更换一次II型培养基，所述II型培养基为含有10% FBS、1%青/链霉素和2% L-谷氨酰胺的高糖培养基，待脂肪细胞汇合度达到95%后进行分化。

2.根据权利要求1所述的一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法，其特征在于，步骤S2中所述组织块的大小为1-2mm³。

3.根据权利要求1所述的一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法，其特征在于，步骤S3中消化酶溶液与组织块的体积比为2.5-4:1。

4.根据权利要求1所述的一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法，其特征在于，步骤S6中所述差速贴壁法纯化细胞的方法为：将培养瓶置于CO₂浓度为5%的培养箱中恒温37℃培养50-80min，弃去含有非贴壁细胞培养基，用含2%青/链霉素/两性霉素的PBS洗2次，再向培养瓶中加入I型培养基。

5.根据权利要求1所述的一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法，其特征在于，步骤S7中所述培养的条件为37℃、CO₂浓度为5%的培养箱中进行培养。