[发明专利]高效诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法及应用

权利要求书

1.高效诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法，其特征在于：通过慢病毒转染构建过表达长链非编码RNA LINC5657基因的HuMSCs系，以及含有HGF，bFGF，EGF及OSM的IMDM培养基，包括以下步骤：

（1）人脐带间充质干细胞的获取：新鲜脐带获取后置入无菌生理盐水中，至超净台内将脐带华通胶分离置入培养瓶底部贴壁培养，加入含10% 胎牛血清的L-DMEM培养基，置于5%CO₂、37 ℃培养箱中，4-5天后观察组织块周围有梭形细胞生长移除组织块继续加入培养基培养，待细胞达70-80%汇合后进行传代；

（2）分化前准备：第4代HuMSCs接种于培养瓶中，细胞浓度为1×10⁸ /L，培养瓶内是含10% 胎牛血清的L-DMEM培养基，置于5%CO2、37 ℃培养箱中；

（3）慢病毒转染：待细胞达到50%-60%汇合时去除原培养基，加入不含胎牛血清的L-DMEM培养基以及LINC5657慢病毒，挑选单克隆细胞进行扩增，最终得到稳定转染的细胞株；

（4）HuMSC向肝细胞分化：去除原生长培养基，更换为含有HGF，bFGF，EGF及OSM的肝细胞诱导IMDM培养基，置于5%CO2、37 ℃培养箱中；

（5）肝细胞诱导分化培养基每3天更换一次，诱导分化21天后，收获诱导后的细胞。

2.根据权利要求1所述的高效诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法，其特征在于：所述人脐带间充质干细胞为从成人脐带中获得的间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述的高效诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法，其特征在于：HGF浓度为20ng/ml，bFGF的浓度为10ng/ml，EGF浓度为20ng/ml，OSM的浓度为10ng/ml。

4.根据权利要求1所述的高效诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法，其特征在于：IMDM培养基中不含有胎牛血清。

5.根据权利要求1所述的高效诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法，其特征在于：所述人脐带间充质干细胞的细胞表面标志分子通过流式细胞技术方法进行检测，人脐带间充质干细胞不表达或低表达CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR，而强表达间充质干细胞表面特异性抗原CD44、CD73、CD90、CD105。

6.权利要求要求1-5任一项所述制备方法制备得到的人脐带间充质干细胞分化的肝细胞。