[发明专利]高效诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法及应用

说明书

本发明公开了一种高效诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法及应用，通过慢病毒转染构建的稳定表达长链非编码RNA LINC5657的人脐带间充质干细胞，以及含有细胞因子HGF、bFGF、EG、OSM的培养基。本发明肝细胞诱导分化培养基每3天更换一次，仅需21天左右即可获得具有肝细胞形态、功能的肝样细胞（iHeps），且细胞功能较传统方法更加成熟，可为临床肝细胞移植提供可靠的细胞来源。

技术领域

本发明属于干细胞与再生医学技术领域，主要涉及过表达LINC5657的人脐带间充质干细胞株在一种含有诱导剂HGF、EGF、bFGF和OSM的培养基中高效分化为肝细胞的方法。

背景技术

各种终末期肝病常常导致肝功能衰竭，给人类健康造成极大危害，是当今世界范围内死亡的主要原因之一。目前肝细胞移植被认为是治疗急慢性肝衰的重要手段之一，但因缺乏足够的供体限制了其在临床上广泛应用。

近年来随着干细胞技术的飞速发展，成人干细胞为体外研究提供了无限制的原代细胞来源。成人干细胞中以间充质干细胞最具应用前景，其具有来源充足、免疫原性低、可塑性好等优点。因此，间充质干细胞体外向肝细胞诱导分化逐渐成为国内外研究的热点，研究证实，在体外添加生长因子及细胞因子可以诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞，使其成为理想的替代肝细胞来源，充满应用前景。但是现阶段上述方法诱导分化来的肝细胞功能不成熟、目标细胞得率低下，而且临床应用移植细胞需要尽可能缩短诱导周期，上述诱导的方法往往至少需要1个月的时间，因此现有诱导方法难以满足临床需要，因此开发新的能够在短时间内将HuMSCs高效地诱导为成熟肝细胞的方法意义重大。

最近几年，越来越多的学者发现长链非编码RNA（lncRNA）在细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化等过程中均扮演着重要角色，并通过干预lncRNA的表达达到了促进细胞分化的目的。因此，我们希望可以将lncRNA用于诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的过程中。

发明内容

本发明的首要目的是克服现有技术的缺点和不足，提供一种高效诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法，通过慢病毒转染构建的稳定表达长链非编码RNA LINC5657的人脐带间充质干细胞株，并且使用一种含有诱导剂HGF、EGF、bFGF和OSM的培养基进行干细胞的诱导分化。与目前普遍的诱导方法相比，极大提高了诱导效率。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

高效诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法，通过慢病毒转染构建过表达长链非编码RNA LINC5657基因的HuMSCs系，以及含有HGF，bFGF，EGF及OSM的IMDM培养基。

具体的包括以下步骤：

（1）人脐带间充质干细胞的获取：新鲜脐带获取后置入无菌生理盐水中，至超净台内将脐带华通胶分离置入培养瓶底部贴壁培养，加入含10% 胎牛血清的L-DMEM培养基，置于5%CO₂、37 ℃培养箱中，4-5天后观察组织块周围有梭形细胞生长移除组织块继续加入培养基培养，待细胞达70-80%汇合后进行传代；

（2）分化前准备：第4代HuMSCs接种于培养瓶中，细胞浓度为1×10⁸ /L，培养瓶内是含10% 胎牛血清的L-DMEM培养基，置于5%CO2、37 ℃培养箱中；

（3）慢病毒转染：待细胞达到50%-60%汇合时去除原培养基，加入不含胎牛血清的L-DMEM培养基以及LINC5657慢病毒，挑选单克隆细胞进行扩增，最终得到稳定转染的细胞株；

（4）HuMSC向肝细胞分化：去除原生长培养基，更换为含有HGF，bFGF，EGF及OSM的肝细胞诱导IMDM培养基，置于5%CO2、37 ℃培养箱中；

（5）肝细胞诱导分化培养基每3天更换一次，诱导分化21天后，收获诱导后的细胞。