[发明专利]西洋参环介导等温扩增引物组及鉴定方法

说明书

本发明涉及中药鉴定技术领域，更具体涉及一种对西洋参进行环介导等温扩增的检测方法。本发明利用模板DNA互补结合的特点，在西洋参特异性基因片段序列上设计引物进行环介导等温扩增检测。此方法包括待检样品核酸的提取、环介导等温扩增及产物检测。本发明能从基因组特征上对西洋参进行真伪鉴定，并能对近缘物种人参和西洋参进行区分，此检测方法具有简便、快速、结果可靠和重复性高等优点，可为西洋参的鉴定提供新思路，对规范中药市场具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种西洋参检测方法，更具体涉及西洋参环介导等温扩增的一组引物及其鉴定方法，属于中药材来源品种鉴定技术领域。

背景技术

西洋参为五加科人参属多年生草本植物，是常用的名贵中药,其根、茎、叶、花、果实等均可药用,具有较高的经济价值和药用价值。西洋参大体呈圆柱形、纺锤状，长约3～8cm，直径约0.5～2cm。西洋参表皮细洁，呈淡黄白色，伴有均匀的横向环纹，多见纵皱纹及横向皮孔。质地轻而致密，不易折断，切面光滑平整，粉质，可见放射状纹理及棕黄色的形成层，切片后迎光可见皮部和木部连接处有一似人民币防伪线的亮环。在药理作用方面西洋参具有降血压，改善心肌缺血，提高机体免疫力，治疗糖尿病和增强中枢神经系统的功能。

近年来，西洋参的市场需求量逐年增加，而西洋参的主要生产国包括美国、加拿大和中国，相比之下进口西洋参的价格高于国产西洋参，而西洋参的总体价格要高于园参。在中药市场上西洋参一般被加工成片剂、冲剂或者胶囊的形式进行销售，因此无法利用形态学对市售产品的原材料进行区分。不良厂商常以价格便宜园参冒充西洋参进行售卖，而园参和西洋参的药用价值不尽相同致使无法达到预期的治疗效果，甚至有延误治疗的风险，因此建立准确可靠的西洋参快速检测体系尤为重要。

目前主要依靠传统形态学和化学分析法对人参属植物进行鉴定，但形态学法需要长期经验的积累，受主观因素影响较大。化学分析法主要依赖于高效液相色谱仪器进行鉴别，但其耗时长，价格比较昂贵，且难以对参片及参粉等参类产品进行鉴定。近年来，DNA分子标记广泛应用于中药的鉴定，其中包括以分子杂交为核心的随机扩增多态性DNA标记(RAPD)，以PCR为核心的限制性片段长度多态性(RFLP)，扩增片段长度多态性(AFLP)和简单重复序列标记(SSR)，以直接DNA序列分析为核心的单核苷酸多态性(SNP)。其中RAPD法难以保证结果的稳定性和重复性。RFLP和AFLP标记均需酶的参与且检测周期长，需要不只一次PCR扩增。SSR标记检测依赖聚丙烯酰胺凝胶电泳且难以实现自动化。SNP标记重复性差且难以解决非特异性扩增的问题，虽然上述方法均能对西洋参进行鉴别，但其准确性，灵敏度及检测时长不适合于大批量对市售产品进行鉴定。

目前LAMP方法大多用于病毒和细菌检测，尚无应用此技术进行人参和西洋参鉴别的研究。LAMP技术仅需恒温扩增，对仪器要求低，不用PCR仪；能进行可视化检测，操作简单易行；反应速度快，敏感性高；应用多个引物进行反应，特异性好；价格便宜，适用于基层推广等优点。其检测试剂稳定性强，适于大批量样品且易于自动化检测。目前现行的形态学，化学分析和分子生物学方法检验过程相对复杂，不适于进行高通量检测。本发明涉及一种西洋参环等温扩增检测方法，其应用范围为全国各级质量监督检验部门、药品检验部门、中药的生产、销售、使用单位等，与目前广泛应用的高效液相色谱法相比，检测周期短，应用机器成本低，保证了西洋参的形态，不影响其二次销售。

发明内容

本发明旨在提供一种西洋参环介导等温扩增检测方法，首先设计扩增引物，然后再用环介导等温扩增引物进行扩增，最后通过可视化检测，琼脂糖凝胶电泳和实时荧光曲线(RT-LAMP)来实现西洋参的检测。

本发明根据NCBI中获得的西洋参特异性P450基因，通过PrimerExplorer V5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计特异性引物，预计西洋参片段大小为155bp，而其近缘物种人参片段大小为520bp(图1)。环等温介导BstDNA聚合酶的性质使得其最适扩增片段为100-300bp,人参特异性片段无法有效扩增，而西洋参特异性片段155bp能较好的扩增出来。