[发明专利]一种人血浆中米拉贝隆的定量分析方法

说明书

一种人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，属于生物分析领域。本发明采用蛋白沉淀处理人血浆样本，以米拉贝隆‑d5为内标，采用高效液相色谱‑质谱联用（LC‑MS/MS）方法检测人血浆中米拉贝隆的含量。采用本发明的检测方法，灵敏度高、专属性强、稳定性高、回收率高，既能满足回收率的要求，又可以提高检测效率。此外，本检测方法的重现性好，分析时间短，能满足米拉贝隆在人血浆中浓度的检测要求，可用于米拉贝隆缓释片药代动力学研究和生物等效性研究。

技术领域

本发明属于生物分析领域，具体涉及一种液质联用技术（LC-MS/MS）定量检测血浆中米拉贝隆的方法。

背景技术

米拉贝隆一种有效的选择性β3肾上腺素受体激动剂，临床适用于治疗膀胱过度活动症引起的尿急、尿频及急迫性尿失禁。在健康志愿者中口服给予米拉贝隆后，约3.5小时达到最大血浆浓度（C_max）。在剂量25 mg时绝对生物利用度为29%，在剂量50 mg时增加至35%。高脂餐后给于50mg米拉贝隆，C_max 和AUC分别降低45%和17%。与低脂肪餐同服时，米拉贝隆C_max和AUC分别降低75%和51%。米拉贝隆经多种途径代谢，包括脱烷基化、氧化、（直接）葡萄糖醛酸化和酰胺水解。14C-米拉贝隆单剂量给药后血液中存在的主要形式为米拉贝隆。人血浆中存在两种主要代谢物，均为二相代谢的葡萄糖醛酸苷，分别占总暴露量的 16%和 11%。这些代谢物无药理学活性。

目前，国内尚未有报道过受试者体内米拉贝隆的定量检测技术以及在临床一期生物等效性试验的应用，国外文献报道的方法均为液液萃取或固相萃取技术，费时费力，操作麻烦，实用性较差。为加速我国仿制药的研究和发展，并解决我国目前药品短缺的局面，亟需建立一种高灵敏、高通量的米拉贝隆定量分析方法。

发明内容

本发明为了解决现有技术中操作麻烦、实用性较差的缺点或不足，采用了蛋白沉淀样本前处理的方案，从而实现了高灵敏、高通量地定量测定人血浆中米拉贝隆的目的。

本发明通过蛋白沉淀的样本处理方式从人血浆中提取米拉贝隆，将提取过的样本进行液质联用分析。采用本发明的检测方法，灵敏度高、专属性强、稳定性高、回收率高，既能满足回收率的要求，又可以提高检测效率。

本发明的技术方案如下：

一种人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，将待测人血浆样本通过蛋白沉淀法对待测样本处理后，采用含甲酸和甲酸铵的水作为流动相A，用含甲酸和甲酸铵的甲醇作为流动相B，进行LC-MS/MS分析测定。

流动相体系含有甲酸铵，尝试加入不同浓度的甲酸铵，在一种优选方案中，甲酸铵的浓度为5mmol/l，既保证分析物米拉贝隆的响应，又确保主峰周围没有杂质峰的干扰。

流动相体系中含有甲酸，尝试加入不同浓度甲酸，在保证杂质峰不影响主峰的前提下，进一步优选含甲酸的体积为流动相总体积的0.1%，使质谱离子化效率提高。

流动相有机相为甲醇体系，优化过程中发现若流动相采用乙腈在色谱柱上保留过弱，并且响应也有所降低，因而排除乙腈使用甲醇。流动相采用梯度洗脱，初始比例设置为25%流动相B，优化过程中将梯度直接提高至90%流动相B，米拉贝隆和血浆中的杂质共同洗脱出，干扰分析；因而将梯度提高至55%流动相B，使米拉贝隆优先洗脱出，再进一步提高到90%的流动相B，使血浆中杂质洗脱出，并且杂质峰与主峰分离度良好，不干扰米拉贝隆的分析。详细洗脱比例见下表1。

表1 洗脱比例