[发明专利]一种人血浆中米拉贝隆的定量分析方法

权利要求书

1.一种人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，其特征在于，将待测人血浆样本通过蛋白沉淀法对待测样本处理后，采用含甲酸和甲酸铵的流动相进行LC-MS/MS分析测得。

2.根据权利要求1所述的人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，其特征在于，所述流动相中甲酸铵的浓度为5mmol/l；优选为含甲酸的甲酸铵体系；更优选，含甲酸的体积为流动相总体积的0.1%；采用Synergi Hydro-RP C18作为色谱柱，优选该色谱柱的长度为50mm，内径为2.0mm，填料粒径为4μm。

3.根据权利要求1、2所述的人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，其特征在于，采用米拉贝隆-d5作为内标。

4.根据权利要求1所述的人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，其特征在于，待测样品加入内标和沉淀剂，涡旋、离心后取上清进行LC-MS/MS分析测得。

5.根据权利要求1、2所述的人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，人空白血浆中加入2.50mg/ml 氟化钠作为稳定剂，用以配制含基质的生物样本。

6.根据权利要求5所述的人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，其特征在于，它包括以下步骤：

标准工作溶液的配制：

称取米拉贝隆标准品，经过折算，加入一定体积的甲醇溶解，配制成浓度为2.00mg/ml的米拉贝隆储备液，至少配制两份标准品储备液，一份作为标准曲线储备液，一份作为质控储备液，以空白溶剂（甲醇/水=80/20）为稀释液，将所述米拉贝隆标准曲线储备液稀释成梯度为3.00~1600ng/ml标准曲线工作溶液；以空白溶剂（甲醇/水=80/20）为稀释液，将所述米拉贝隆质控储备液稀释成梯度为3.00~1200ng/ml质控工作溶液；称取米拉贝隆-d5内标标准品，加入一定体积的甲醇溶解混匀，配制成浓度为200μg/ml的内标储备液，以空白溶剂（甲醇/水=80/20）为稀释液，将内标储备液稀释成5.00ng/ml的内标工作溶液，所有储备液、工作液分装后-20℃保存备用；

取健康人空白血浆，分别加入所述米拉贝隆工作溶液，涡旋混匀，配制成浓度范围为0.150~80.0ng/ml的标准曲线样本以及浓度范围为0.150~60.0ng/ml的质控样本；

样本处理：

吸取标准曲线样本、质控样本、待测样本50.0μl，加入50.0μl内标工作溶液混匀（空白样本加入50μl空白溶剂），加入300μl甲醇沉淀蛋白，涡旋后离心10分钟，取100μl上清液，用300μl流动相A稀释，涡旋摇匀后进行LC-MS/MS测定；

标准曲线制作：

将经步骤（2）处理后的校正标样、质控样本进行LC-MS/MS分析测定，以米拉贝隆的峰面积与内标米拉贝隆-d5的峰面积比作为纵坐标，以人血浆中米拉贝隆浓度为横坐标制作标准曲线，并进行线性回归；

定量分析

将经步骤（2）处理后的待测生物样本，按照步骤（3）所得的标准曲线方程计算，得到待测生物样本中米拉贝隆的浓度。

7.根据权利要求6所述的人血浆中米拉贝隆的定量分析方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述米拉贝隆工作液浓度为3.00ng/ml、6.00ng/ml、16.0ng/ml、40.0ng/ml、80.0ng/ml、320ng/ml、640ng/ml、1280ng/ml、1600ng/ml；所述米拉贝隆质控工作溶液浓度为：3.00ng/ml、9.00ng/ml、72.0ng/ml、360ng/ml、1200ng/ml；所述校正标样和所述质控样本为新鲜配制；所述校正标样的浓度为：0.150ng/ml、0.300ng/ml、0.800ng/ml、2.00ng/ml、4.00ng/ml、16.0ng/ml、32.0ng/ml、64.0ng/ml、80.0ng/ml；所述质控样本的浓度为：0.150ng/ml、0.450ng/ml、3.60ng/ml、18.0ng/ml、60.0ng/ml。