[发明专利]一种微量精子的冻存方法以及一种直接用于ICSI的精子制备方法

说明书

本发明涉及辅助生殖技术领域，公开了一种微量精子的冻存方法以及一种直接用于ICSI的精子制备方法。本发明冻存方法将预冻存精液样本预处理制备成精子悬液；剥卵针吸取微量精子悬液后打出，在针尖外聚集成微滴，将剥卵针置于液氮中固化微滴；在液氮环境中，将剥卵针装入保护套管，然后冻存在液氮中。本发明采用商品化塑料剥卵针作为冷冻载体，并通过对不同冷冻方法的比较认为可以不添加精子冻存液，将处理后的精子悬液吸入剥卵针后推出到管外，使其在针尖聚集成微滴，直接投入液氮即可获得较为理想的效果，且该冻存方法解冻便捷，无需离心等操作可直接复苏后进行ICSI操作，对冻存精子的损伤小，便捷性更高，具有推广应用于临床实践的潜力。

技术领域

本申请涉及辅助生殖技术领域，尤其涉及一种微量精子的冻存方法以及一种直接用于ICSI的精子制备方法。

背景技术

近年来随着不孕不育日益成为社会关注的重要问题，辅助生殖领域的各种技术方法得到了快速发展，其中男性生育力保存也获得了广泛的关注与研究。当前最主要的方法是精液冷冻保存，这种方法操作简便，可靠性较高，适合精液化验正常的标本冷冻。但是由于中国男性随时间变化精液质量呈下降趋势，在临床中遇到越来越多的少弱畸精甚至无精症患者，为了避免在取卵日无法获得足量有活力的精子，提前将患者精子进行冷冻是最有效的手段之一，而同时这也对微量精子冷冻提出了新的要求。

微量精子冷冻与常规精液冷冻有很大不同，首先由于微量精子冷冻由于活动精子数量极少，这就对精子冷冻后的回收率和复苏率有较高要求；其次微量精子解冻后通常只能用于ICSI(卵胞浆内单精子显微注射技术)，所以很多冷冻载体如Cryopiece和冷冻薄片等可以在ICSI操作皿中复苏后直接行ICSI操作。同时，微量精子冷冻也需要满足常规精液冷冻操作简便，重复性好，耗材易得的要求，这样才能具备推广应用的潜力。

目前报道的冷冻载体大多已能得到较为理想的回收率和复苏率，很多也可以与ICSI操作皿配套使用，但是尚没有出现广泛应用的载体，主要还在于这类耗材本身需求量不大，无法规模化量产，主要靠实验室自制或者定制，导致成本居高不下，质量不够稳定，另外操作也比较复杂，对实验人员操作水平要求较高。杨志勇等采用商品化玻璃剥卵针作为冷冻载体，将最多10微升的由稀释精液和冻存保护剂组成的混合物置于剥卵针内，并在两端以矿物油封堵，针尖前端预留1-1.5cm空气柱。

虽然商品化的剥卵针成本低且采购方便，为微量精子冷冻载体的发展提出了新的思路，但是该现有文献公开的方法在简便性上仍然较为复杂，该方法解冻后的精子复苏率可达到55％，主要是该方法冷冻的精液中精浆对精子有较好的保护作用，可以减少冷冻对精子的损伤，但是该种方法只适用于精子质量较好的精液。一个人正常射精后的精液量大约1-3mL，再与等体积冷冻保护剂混合后总体积可达到2-6mL，而该方法每支剥卵针可以冷冻10微升精液，如果要将精液全部冷冻需要200-600支剥卵针，每支剥卵针价格按照70元算，共需1.4万-4.2万元，这在实际操作过程是难以接受的成本。而且，冷冻的微量精子只能通过ICSI技术完成卵母细胞的授精，该篇文献中的冷冻方法冻存的精液解冻后仍然需要进行梯度离心去除精浆，一方面解冻后的精液离心会对精子头部造成不可逆的损伤，另一方面离心会带来一定的精子丢失，所以解冻后的精液经过离心后的精子复苏率则会收到很大程度的影响，且不利于后续ICSI的操作便利性。

影响微量精子冷冻保存的另一重要因素是技术本身的复杂程度，一般的辅助生殖实验室操作步骤多，工作强度大，尽可能简化技术本身的难度和耗费时间将大大提高该项技术的可行性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种微量精子的冻存方法，使得所述冻存方法能够简便易行且同时保证较高的精子复苏率；

本发明的另外一个目的在于提供一种直接用于ICSI的精子制备方法，使其降低从精子冻存、解冻到实施ICSI的复杂程度，整体具有较高的ICSI适配性，简化ICSI的操作。

为了解决上述技术问题或者至少部分地解决上述技术问题，本发明提供了一种微量精子的冻存方法，包括：