[发明专利]一种微量精子的冻存方法以及一种直接用于ICSI的精子制备方法

权利要求书

1.一种微量精子的冻存方法，其特征在于，包括：

步骤1、将预冻存精液样本预处理制备成精子悬液；

步骤2、剥卵针吸取微量精子悬液后打出，在针尖外聚集成微滴，然后将剥卵针置于液氮中固化微滴；

步骤3、在液氮环境中，将剥卵针装入保护套管，然后冻存在液氮中。

2.根据权利要求1所述冻存方法，其特征在于，步骤1为：

将预冻存精液样本用梯度离心法洗涤，所获精子沉淀加入到预平衡的受精培养液中离心，弃部分上清后剩余上清液体将精子沉淀重悬制成精子悬液。

3.根据权利要求2所述冻存方法，其特征在于，所述受精培养液为K-SIFM-20受精培养液。

4.根据权利要求2所述冻存方法，其特征在于，所述梯度离心法为：

取高浓度密度梯度液加入试管底部，再沿管壁缓慢加入低浓度密度梯度液，注意勿混匀，两液体间应有清晰的界面，在两液体上面缓慢加入已液化的精液，离心去除离心管上部的精浆和密度梯度液，收集底部的精子沉淀。

5.根据权利要求1所述冻存方法，其特征在于，所述微量为不超过3μL。

6.根据权利要求1所述冻存方法，其特征在于，所述剥卵针为塑料剥卵针。

7.根据权利要求1或6所述冻存方法，其特征在于，所述剥卵针的内径为140μm。

8.一种直接用于ICSI的精子制备方法，其特征在于，按照权利要求1-7任意一项冻存方法对精子进行冻存，在需要进行ICSI时进行解冻，解冻时把装有剥卵针的保护套管从液氮中取出，将剥卵针前端伸入ICSI操作皿的培养油中复苏，当固化的微滴完全融化重新变成液态微滴时完成复苏，移动剥卵针将精子悬液微滴与ICSI操作皿的配子缓冲液微滴融合，用于后续ICSI操作。

9.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述培养油为石蜡油。

10.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述配子缓冲液为K-SIGB-20型配子缓冲液。