[发明专利]一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法

说明书

本发明涉及一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法，其将消化后的贴壁细胞接种至盛有无血清培养基中进行离心沉降，然后在转瓶和摇瓶中以特定的温度、通气、转速等条件下进行特定时长的一次分布增值培养和二次分布增殖培养，最后经5次高存活率传代和5次以上纯化迭代，驯化得到全悬浮细胞系。本方法还提供了一种无血清培养基。本方法克服了现有悬浮驯化技术细胞贴壁展开面积对效率和产量的限制，以及培养过程中对血清的依赖，其不仅减少了工艺步骤、而且缩短了增值周期，而且其培养基在提供细胞驯化过程所需的营养物质的同时，不仅成本低、保藏时间长，而且质量稳定，有效的实现了生产规模的扩大，并保证了下游治疗性蛋白质和疫苗的纯化效率。

技术领域

本发明涉及细胞驯化技术领域，属于生物技术领域，具体涉及一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法。

背景技术

将贴壁细胞驯化成为全悬浮细胞是国内外研究和大规模生产治疗性蛋白质和疫苗发展的趋势。然而，使用贴壁细胞时，为了让细胞能够附着，必须使用如瓶和微载体等以形成细胞单层，在大量生产时还需要使用更大的培养容器或反应器；另外在培养贴壁细胞时，培养基中须加入一定量的动物血清，用于细胞提供生长因子和满足细胞贴壁需求的各种营养物质，动物血清存在成本高、难保存、批次间质量不稳定等问题，其直接影响得到驯化后的悬浮系品质。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何克服现有技术的上述缺陷，提供一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法。

本贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法包括以下步骤，

S1沉降：将目标细胞的贴壁细胞复苏，选择汇合度不小于20％的贴壁细胞，用0.2％的胰蛋白酶EDTA消化沉淀的细胞团，将消化细胞接种至盛有无血清培养基的离心管中，置于离心机中以1000rpm离心沉降，将沉淀转移至转瓶中培养；

S2一次分布：将转瓶置于转瓶机内以3rpm，于温度37℃、CO₂浓度5％条件下培养，每24h取样计数一次，续培养至96h，若96h活细胞密度高于2.0×10⁶cells/mL，将使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0×10⁶cells/mL，转瓶机调整至6rpm继续培养96h；若96h细胞密度低于1.0×10⁶cells/mL，转瓶机停转静置沉降，弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.5×10⁶cells/mL，继续培养96h；

S3二次分布：当二次96h培养后，细胞密度增长达到2.0×10⁶cells/mL后，将细胞转到摇瓶中，添加新的无血清培养基将细胞起始密度调整至5×10cells/mL，将摇瓶置于培养箱摇床中以30rpm于温度于温度37℃、CO₂浓度5％条件下，继续培养120h；

S4传代：120h后稀释传代，经连续5代摇瓶传代，保持120h活细胞密度增加不小于5倍，且活率高于95％，即可完成驯化，再经过至少5代摇瓶传代驯化培养后，即得到全悬浮细胞系。

具体的，所述无血清培养基按以下质量/体积比制备，

4000mg/L D-葡萄糖、100mg/L丙酮酸钠、40mg/L L-天冬酰胺、70mg/L L-丝氨酸、15mg/L次黄嘌呤、0.6mg/L胸苷、6mg/L胞苷和9mg/L鸟苷、8mg/L叶酸、0.6mg/L核黄素、4mg/L氯化胆碱、30mg/L肌醇、20～30mg/L硝酸铁、0.6mg/L硫酸亚铁、300mg/L氯化钾、700mg/L氯化钠、70mg/L磷酸氢二钠、60～70mg/L磷酸二氢钠，以及2000mg/L剪切力保护剂和70mg/L抗细胞结团剂。

具体的，所述目标细胞为Vero细胞、HEK-293T细胞、BHK-21细胞、PK-15细胞、NBL-6细胞或RK-13细胞。

进一步的，步骤S1所述离心沉降时间为3～5min。