[发明专利]一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法

权利要求书

1.一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法，其特征是：所述驯化方法包括以下步骤，

S1沉降：将目标细胞的贴壁细胞复苏，选择汇合度不小于20％的贴壁细胞，用0.2％的胰蛋白酶EDTA消化沉淀的细胞团，将消化细胞接种至盛有无血清培养基的离心管中，置于离心机中以1000rpm离心沉降，将沉淀转移至转瓶中培养；

S2一次分布：将转瓶置于转瓶机内以3rpm，于温度37℃、CO₂浓度5％条件下培养，每24h取样计数一次，续培养至96h，若96h活细胞密度高于2.0×10⁶cells/mL，将使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0×10⁶cells/mL，转瓶机调整至6rpm继续培养96h；若96h细胞密度低于1.0×10⁶cells/mL，转瓶机停转静置沉降，弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.5×10⁶cells/mL，继续培养96h；

S3二次分布：当二次96h培养后，细胞密度增长达到2.0×10⁶cells/mL后，将细胞转到摇瓶中，添加新的无血清培养基将细胞起始密度调整至5×10cells/mL，将摇瓶置于培养箱摇床中以30rpm于温度于温度37℃、CO₂浓度5％条件下，继续培养120h；

S4传代：120h后稀释传代，经连续5代摇瓶传代，保持120h活细胞密度增加不小于5倍，且活率高于95％，即可完成驯化，再经过至少5代摇瓶传代驯化培养后，即得到全悬浮细胞系。

2.根据权利要求1所述的贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法，其特征是：所述无血清培养基按以下质量/体积比制备，

4000mg/L D-葡萄糖、100mg/L丙酮酸钠、40mg/L L-天冬酰胺、70mg/L L-丝氨酸、15mg/L次黄嘌呤、0.6mg/L胸苷、6mg/L胞苷和9mg/L鸟苷、8mg/L叶酸、0.6mg/L核黄素、4mg/L氯化胆碱、30mg/L肌醇、20～30mg/L硝酸铁、0.6mg/L硫酸亚铁、300mg/L氯化钾、700mg/L氯化钠、70mg/L磷酸氢二钠、60～70mg/L磷酸二氢钠，以及2000mg/L剪切力保护剂和70mg/L抗细胞结团剂。

3.根据权利要求2所述的贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法，其特征是：所述目标细胞为Vero细胞、HEK-293T细胞、BHK-21细胞、PK-15细胞、NBL-6细胞或RK-13细胞。

4.根据权利要求3所述的贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法，其特征是：步骤S1所述离心沉降时间为3～5min。

5.根据权利要求3所述的贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法，其特征是：步骤S1所述静置沉降静置沉降时间为2～4h。

6.根据权利要求4或5所述的贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法，其特征是：所述全悬浮细胞系的比生长速率μ不小于8h-1。