[发明专利]一种具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒及质粒提取方法

权利要求书

1.一种具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒，该试剂盒包括裂解试剂组、杂质去除试剂组、内毒素去除试剂组、质粒回收试剂和内毒素检测试剂；其特征在于，

所述裂解试剂组用于裂解细胞，所述裂解试剂组包括试剂一和试剂二,所述试剂一包含1%的tritonX-100和苯甲基磺酰氟溶液，所述tritonX-100和苯甲基磺酰氟溶液的体积比为100:1.5，所述试剂二包含NP-40 Lysis Buffer和苯甲基磺酰氟溶液,所述NP-40 LysisBuffer和苯甲基磺酰氟溶液的体积比为100:1.5；

所述杂质去除试剂组用于从细胞破碎液得到质粒粗提液，所述杂质去除试剂组包括试剂三和试剂四；

所述质粒回收试剂用于将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒；

所述内毒素去除试剂组用于去除溶液中的内毒素，所述内毒素去除试剂组包括试剂五、试剂六和试剂七，所述试剂五、试剂六和试剂七的体积比为1.5：125:125；

所述内毒素检测试剂用于检测所得的质粒溶液中内毒素含量。

2.根据权利要求1所述的一种具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒，其特征在于，所述试剂三中包含6-8M盐酸胍、20mM Tris-HCl、乙醇和水，所述试剂四包含乙醇和水。

3.根据权利要求1所述的一种具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒，其特征在于，所述试剂五为1.5ml亲和树脂预装柱，所述试剂六为125ml再生缓冲液，其中包含1MTris-HCl、0.5M EDTA和1M葡萄糖，所述试剂七为125ml平衡缓冲液，其中包含2M NaOH和10%SDS，所述试剂六和试剂七的PH值为8。

4.根据权利要求1所述的一种具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒，其特征在于，所述质粒回收试剂为含有聚乙二醇和二甲基亚砜的水溶液。

5.根据权利要求1所述的一种具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒，其特征在于，所述内毒素检测试剂为包含5- 20％TritonX-114的水溶液。

6.一种质粒提取方法，其特征在于包括根据权利要求1-5所述的一种具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒，其步骤如下：

步骤一：获取细胞破碎液：

a）: 根据需要，选用试剂一或试剂二，将1%的tritonX-100或NP-40 Lysis Buffer在室温下溶解混匀，然后加入苯甲基磺酰氟溶液，使溶液最终浓度达到1mM;

b）: 将待处理的培养液低速离心1-3min，弃上清液，留取沉淀物;

c）:往沉淀物中加入步骤一中的溶液，用移液器轻轻吹打，使溶液与细胞充分接触，离心后取上清液，所得上清液为细胞破碎液;

步骤二：获取质粒粗提液：

a）:将细胞破碎液上载于质粒吸附柱上，离心并滤出质粒吸附柱上的液体;

b）: 用试剂三洗涤质粒吸附柱，离心并滤出质粒吸附柱的液体;

c）: 用试剂四洗涤质粒吸附柱，离心并滤出质粒吸附柱的液体，重复操作两次，得到的滤液即为质粒粗提液;

步骤三：以1000:40~60的比例，往质粒粗提液中加入质粒回收试剂，振荡1-3min后，高速离心，去除上清液，得到带有内毒素的回收质粒溶液；

步骤四：去除内毒素：

a）：调节回收质粒溶液的PH值，使回收质粒溶液的PH值为6-9，将亲和树脂预装柱置于铁架台上，垂直固定，去除亲和树脂预装柱顶部盖子，使保护液在重力作用下流干，往亲和树脂预装柱中加入5ml预冷过的试剂六，保持流速在0.25ml/min待试剂六流干后，再次加入5ml试剂六，然后重复操作两次；

b）：加入6ml预冷过的试剂七，流速不高于0.25ml/min，流出液体积达到1.5ml后，使用无热原接收管接受带有内毒素的回收质粒溶液，溶液流干后，再加入1.5-3ml预冷过的试剂七，收集质粒溶液；

步骤五：通过质粒溶液内毒素检测试剂对质粒溶液的内毒素含量进行检测，若未能达到预期值，则重复步骤四的操作；

步骤六：将质粒溶液以高速离心1分钟停30秒的规律，重复操作5次，彻底去除残留液体，得到质粒，并于-20℃保存。