[发明专利]一种大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统

说明书

本发明的目的是为了开发一种大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统。以pWRKY28驱动人工转录因子VGE表达，构建细胞特异性诱导表达系统，并将报告基因Vennus构建到表达系统中，导入拟南芥植株中，观察它们在胚珠的不同时期，特别是MMC时期的表达情况，得到一个大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统。

背景技术

被子植物雌雄配子的发育，都是由大孢子母细胞经过减数分裂，最终形成精细胞与卵细胞，通过受精作用结合，发育成为新的个体植株。植物的双受精过程，是花粉传播到柱头时，花粉管经过珠孔进入珠心，最后进入胚囊，一个精细胞与中央细胞结合，发育成为胚乳，另一个精细胞与卵细胞结合最终发育成为胚。大孢子母细胞是由紧接表皮下的珠心组织的细胞分化产生的，此细胞比周围的细胞大，细胞质丰富，可产生核大的孢原细胞，有的能直接成为胚囊母细胞，有的可成为覆盖细胞和胚囊母细胞。拟南芥的雌配子体是由一个孢原细胞（二倍体体细胞）经过减数分裂、有丝分裂和细胞分化发育而成。拟南芥雌配子体发育分为两个阶段：一是大孢子发生阶段，胚珠原基顶端的1个亚表皮细胞分化形成大孢子母细胞，大孢子母细胞经过一次减数分裂形成4个单倍体大孢子，随着发育进行，处在珠孔端的3个大孢子退化，仅剩合点端的一个大孢子即功能大孢子幸存并参与雌配子体发生；二是雌配子体发生，功能大孢子的形成开始，其经过三次连续核有丝分裂形成合胞体，再经过细胞化，最终形成“七胞八核”的雌配子体（胚囊）的过程。

发明内容

本发明的目的在于提供可以用于在大孢子母细胞外围细胞可诱导的表达目标基因的系统：ipWRKY28-VENUS，其特征是该系统所驱动的蛋白只在有诱导剂存在的情况下在大孢子母细胞外围细胞中特异性表达。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案构建该系统：

一种大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统，以pWRKY28与报告基因Venus连接构建载体，构建细胞特异性诱导表达系统，导入拟南芥植株中，在诱导剂存在的条件下，观察报告基因在胚珠的不同时期的荧光表达情况，得到一个大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统。所述报告基因Venus序列如SEQ ID NO:1所示；所述pWRKY28序列如SEQ IDNO:2所示。

所述载体的构建方法具体包括以下步骤：

1）根据AT4G18170 基因全基因组序列设计扩增pWRKY28的引物，利用引物从拟南芥中扩增WRKY28基因的启动子；

引物序列：

Forward Primer：ctagGCGATCGCCacatcaccaaaagttatcctctc；

Reversed Primer：gatcCGTCGACGGGGTGAAGAACAATGAAGAGAGAGG；

2）采用SfaA1合SgrDI双酶切pWRKY28片段，并回收带有粘性末端的启动子片段pWRKY28；

3）采用SfaA1合SgrDI双酶切piGL载体骨架，并回收载体骨架piGL；

4）T4-DNA连接酶连接piGL载体骨架和pWRKY28，转化大肠杆菌DB3.1挑选单克隆，得到ipWRKY28-GL载体；