[发明专利]一种大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统在审

申请号：	202111071465.2	申请日：	2021-09-14
公开（公告）号：	CN114085864A	公开（公告）日：	2022-02-25
发明（设计）人：	程焱;秦源;杨攀;熊俊杰;林志斌	申请（专利权）人：	福建农林大学
主分类号：	C12N15/82	分类号：	C12N15/82;C12N15/29;C12N15/66;C12N15/65;A01H5/00;A01H6/20
代理公司：	福州元创专利商标代理有限公司 35100	代理人：	蔡学俊
地址：	350002 福***	国省代码：	福建;35
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摘要：
搜索关键词：	一种大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统
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【权利要求书】：

1.一种大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统，其特征在于，以pWRKY28与报告基因Venus连接构建载体，构建细胞特异性诱导表达系统，导入拟南芥植株中，在诱导剂存在的条件下，观察报告基因在胚珠的不同时期的荧光表达情况，得到一个大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统；所述报告基因Venus序列如SEQ ID NO:1所示；所述pWRKY28序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统，其特征在于，所述载体的构建方法具体包括以下步骤：

1）根据AT4G18170 基因全基因组序列设计扩增pWRKY28的引物，利用引物从拟南芥中扩增WRKY28基因的启动子；

2）采用SfaA1合SgrDI双酶切pWRKY28片段，并回收带有粘性末端的启动子片段pWRKY28；

3）采用SfaA1合SgrDI双酶切piGL载体，并回收piGL载体骨架；

4）T4-DNA连接酶连接piGL载体骨架和pWRKY28，转化大肠杆菌DB3.1挑选单克隆，得到ipWRKY28-GL载体；

5） ipWRKY28-GL载体与pENTER-Venus载体LR交换反应，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，提取质粒，得到pWRKY28：：VGE-5×GAL4 DNA：：Venus。

3.根据权利要求1所述的大孢子母细胞外围细胞特异性诱导表达系统，其特征在于，所述诱导的方法具体包括以下步骤：

（1）将权利要求1所述载体导入农杆菌并转化拟南芥，提取T1代植株DNA，进行PCR鉴定，取阳性苗植株诱导；

（2）诱导前，对目标植株停止浇水三天，让栽培基质适当干燥；

（3）诱导时，配置浓度为200 ug/L Methoxyfenozide作为诱导剂，将目标植株地上部分放在诱导液中浸泡60S，然后用诱导液浇灌栽培基质致其吸水饱和，2小时候后用诱导液对植株的花序进行喷雾；

（4）诱导后，培养24小时取胚珠观察荧光情况；

（5）诱导表达并观察Vennus信号。