[发明专利]一种水稻Osspear2突变体植株的制备方法

说明书

本发明公开了一种水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其包括步骤：筛选水稻基因OsSPEAR2的sgRNA靶点序列；根据所述sgRNA靶点序列设计上、下游引物；将所述上游引物和下游引物混合并进行退火处理，形成双链DNA；用限制性内切酶对质粒进行酶切得到线性质粒；用T4DNA连接酶连接所述线性质粒和双链DNA得到连接产物，所述连接产物经转化、筛选得到重组质粒；将所述重组质粒导入相应的浸染细菌中，得到含有重组质粒的浸染细菌，然后用含有重组质粒的浸染细菌侵染水稻愈伤组织；对所述水稻愈伤组织进行诱导获得再生苗，筛选得到转基因阳性植株。本发明获得了一种具有重要应用价值的水稻Osspear2突变体，且所述Osspear2突变体出现花粉败育的现象，对杂交水稻的生产具有重要应用价值。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种水稻Osspear2突变体植株的制备方法。

背景技术

CRISPR/CAS9系统是近年来发展起来的一种基因组DNA编辑技术，其原理是核酸酶Cas9蛋白与单导向RNA(small guide RNA,sgRNA)形成复合体，sgRNA通过碱基互补配对决定靶序列特异性，Cas9蛋白作为核酸酶切割与sgRNA互补的基因组DNA，造成双链DNA损伤，随后通过体内的NHEJ(nonhomologous end joining)修复机制引入基因突变。CRISPR/Cas9技术在设计合成上简便快捷，可同时对多个基因进行编辑，成倍地提高了基因编辑效率，因而成为目前最主要的靶向基因编辑技术，被广泛应用于各种动植物的基因功能研究中。

水稻是世界范围内重要的经济作物和主食来源之一，近年来人口的不断剧增和环境的持续恶化，导致世界粮食问题日益严重，因此培育高产、抗逆的优质水稻品种尤为重要。由于水稻雌雄同株，一旦开花就可完成授粉，所以水稻一般较难杂交，而天然雄性不育株的发现和利用拉开了杂交水稻的序幕。杂种优势是指杂合体在一种或多种性状上优于亲本，是自然界中普遍存在的现象，主要表现在产量增加、器官发达以及抗逆性的提高等方面。杂交水稻被誉为“世界第五大发明”，也是“第二次绿色革命”的象征，而水稻不育系是杂交水稻的核心关键。通过基因工程获得雄性不育系具有极为重要的生产价值，同时对世界粮食生产和粮食危机都有举足轻重的影响，因此水稻的育性研究逐渐成为全球关注的热点。

SPOROCYTELESS(SPL)是有胚植物特有的一个转录抑制因子家族，在植物的发育过程中发挥着不同的作用，目前在陆地植物中发现173个成员。该家族成员的N端都含有一个保守的SPL结构域，C端含有一个乙烯反应元件结合因子相关的两亲性抑制(EAR)结构域，因此被命名为SPL-like,EAR-containing(SPEAR)蛋白。拟南芥、水稻和玉米中分别有5个，6个和8个SPEAR蛋白。

目前已有研究报道，SPEAR基因在拟南芥雄性和雌性生殖器官的形成过程中起关键作用，但水稻中OsSPEAR家族在维持水稻育性方面的功能尚不明晰。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用CRISPR/Cas9技术制备水稻Osspear2突变体植株的方法。

本发明的技术方案如下：

一种水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其中，包括步骤：

筛选水稻基因OsSPEAR2的sgRNA靶点序列，所述sgRNA靶点序列如SEQ ID NO.1所示；

根据所述sgRNA靶点序列设计如SEQ ID NO.2所示的上游引物和如SEQ ID NO.3所示的下游引物；

将所述上游引物和下游引物混合并进行退火处理，形成双链DNA；

用限制性内切酶对质粒进行酶切得到线性质粒；