[发明专利]一种水稻Osspear2突变体植株的制备方法

权利要求书

1.一种水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其特征在于，包括步骤：

筛选水稻基因OsSPEAR2的sgRNA靶点序列，所述水稻基因OsSPEAR2的基因座为LOC_Os01g11430，所述sgRNA靶点序列如SEQ ID NO.1所示；

根据所述sgRNA靶点序列设计如SEQ ID NO.2所示的上游引物和如SEQ ID NO.3所示的下游引物；

将所述上游引物和下游引物混合并进行退火处理，形成双链DNA；

用限制性内切酶对质粒进行酶切得到线性质粒；

用T4 DNA连接酶连接所述线性质粒和双链DNA得到连接产物，所述连接产物经转化、筛选得到重组质粒；

将所述重组质粒导入浸染细菌中，所述浸染细菌为农杆菌，得到含有重组质粒的浸染细菌，然后用含有重组质粒的浸染细菌侵染水稻愈伤组织；

对经过含有重组质粒的浸染细菌侵染的水稻愈伤组织进行诱导获得再生苗，筛选得到转基因阳性植株，即水稻Osspear2突变体植株。

2.根据权利要求1所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其特征在于，所述限制性内切酶为Bsa I，所述质粒为pCAMBIA1390。

3.根据权利要求1所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其特征在于，对经过含有重组质粒的浸染细菌侵染的水稻愈伤组织进行诱导获得再生苗的步骤中，采用潮霉素对水稻愈伤组织进行诱导，得到再生苗。

4.根据权利要求3所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其特征在于，筛选得到转基因阳性植株的步骤中，采用抗潮霉素基因引物进行筛选，所述抗潮霉素基因引物序列为：

Hyg-F：5′-CTATTTCTTTGCCCTCGGACGAG-3′；

Hyg-R：5′-ATGAAAAAGCCTGAACTCACCG-3′。

5.根据权利要求1所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其特征在于，筛选得到转基因阳性植株之后还包括步骤：

对所述转基因阳性植株进行鉴定，所述鉴定是针对sgRNA靶点序列两侧设计引物进行鉴定，鉴定引物序列为：

SPEAR2-test-F:5′-AAGGAATCTTTAAACATACGAACAG-3′

SPEAR2-test-R:5′-GCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAA-3′。

6.根据权利要求5所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其特征在于，对所述转基因阳性植株进行鉴定的步骤包括：

以单株转基因阳性植株的DNA为模板，以SPEAR2-test-F和SPEAR2-test-R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

用限制性内切酶Bsa I酶切所述PCR扩增产物得到酶切产物；

电泳检测所述酶切产物确定突变株。

7.根据权利要求6所述水稻Osspear2突变体植株的制备方法，其特征在于，还包括步骤：

对所述PCR扩增产物进行测序，获得各突变株的突变基因型。