[发明专利]基于慢病毒的猪SPP1基因载体及其构建和应用

说明书

本发明提出了一种基于慢病毒的猪SPP1基因载体及其构建和应用，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。重组慢病毒的猪SPP1基因载体包括含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列；原核复制子pUC Ori序列；病毒复制子SV40 ori序列；用于增强基因表达效率的WPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件；嘌呤霉素抗性基因Puro序列；T2A“自我剪切”肽序列；荧光蛋白表达标签CopGFP序列；慢病毒包装顺式元件cis；人巨细胞病毒CMV启动子；猪SPP1基因序列，所述慢病毒包装顺式元件cis采用第三代慢病毒载体。上述载体能够直接感染真核细胞，从而实现猪SPP1基因在真核细胞中共表达的目的，为进一步研究猪SPP1基因的功能奠定基础。

技术领域

本发明涉及一种基于慢病毒的猪SPP1基因载体及其构建和应用，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。

背景技术

1979年，人们首次在恶性上皮细胞中发现一种分泌蛋白，即分泌型磷酸蛋白1（Secreted phosphoprotein 1，SPP1），也被称为骨唾液蛋白1、骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）和早期1型T淋巴细胞激活蛋白（Eta-1）。SPP1主要以吸附在钙化基质的固定化蛋白和可溶性细胞因子两种形式存在，在多个物种的多种组织中表达，如人、牛、猪和鸡。SPP1具有多种生物学功能，它不仅能影响破骨细胞的运动和融合，调控雪旺细胞的增殖和凋亡，而且还可能在动物脂肪沉积中起着关键的调控作用。肥胖已经成为全球死亡率和慢性病发病率持续增高的重要因素之一，然而，目前却尚无有效的手段能够很好的治疗肥胖。猪在生理功能和生理结构等各方面与人类高度相似，这使得猪成为研究人类肥胖及其并发症的常见模式生物，越来越多的研究尝试以猪为模型以期开发出更有效的肥胖治疗方法。同时畜牧生产中，猪肌内脂肪含量与猪肉的风味、多汁性、嫩度等肉品质评定指标息息相关，因此研究猪在生长发育过程中的脂肪沉积机制对于促进畜牧业发展以及保障人类公共卫生健康具有重要意义。然而，目前调控家畜脂肪沉积和改善肉品质的分子机制仍知之甚少。分泌型磷酸蛋白1（Secreted phosphoprotein 1，SPP1）基因已被证明在多个物种中表达，能参与多种生理过程。已有研究表明，SPP1基因在多个猪种的脂肪组织中相对表达水平较高，以小鼠为模型的研究表明，SPP1的表达水平与小鼠的体重和脂肪量的变化密切相关，但是目前，针对SPP1基因在猪脂肪组织中的功能研究甚少。

猪SPP1基因（Sus scrofa secreted phosphoprotein 1，SPP1)，全长cDNA序列1430bp，GenBank登录号NM_214023，编码区912 bp，编码303个氨基酸，蛋白分子量33，669Da。

慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1（人类免疫缺陷1型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体，可以将外源基因有效的整合到宿主染色体上，具有感染谱广泛，可以有效感染分裂期和静止期细胞，感染效率高等优点，感染效率可达传统质粒转染方法的数倍，因此成为导入外源基因的有力工具。在体外实验和体内实验的研究中，慢病毒正在获得越来越广泛的应用。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于慢病毒的猪SPP1基因载体及其构建和应用。

为了解决上述问题，技术方案如下：

一种基于慢病毒的猪SPP1基因载体，包括按照以下顺序组装的序列：

猪SPP1基因序列如SEQ ID NO.14所述；

用于起始慢病毒mRNA转录的EF-1α启动子，如SEQ ID NO.9所示；

用作荧光蛋白表达标签的CopGFP序列，如SEQ ID NO.7所示；

用于连接同时转录表达蛋白质的T2A“自我剪切”肽序列；如SEQ ID NO.6所示；

用于真核细胞筛选的嘌呤霉素抗性基因Puro序列，如SEQ ID NO.5所示；

用于增强基因的表达效率的WPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，如SEQID NO.4所示；