[发明专利]一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法

说明书

本发明公开了一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法，属于分子生物学领域，本发明包括如下步骤：步骤一，取石蜡包埋的组织样本，获得基因组DNA；用末端修饰酶加ddATP修复；步骤二，采用限制性内切酶消化基因组DNA的CpG岛；步骤三，用末端修饰酶对基因组DNA进行末端修复并在3’端加A‑Tailing；步骤四，用DNA连接酶进行甲基化接头连接，混合样本；步骤五，采用亚硫酸氢盐转化非甲基化胞嘧啶；步骤六，甲基化文库PCR富集；步骤七，切胶回收；本发明解决了现有技术福尔马林浸泡造成的RRBS构建FFPE DNA文库失败率高的问题，具有广大的应用前景和市场价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法。

背景技术

DNA甲基化是在真核生物体中一种DNA化学修饰，可以在不改变DNA序列的情况下改变遗传表现。DNA甲基化通常出现在CpG二核苷酸，通过甲基转移酶的作用增加在胞嘧啶的5’碳位增加一个甲基基团。甲基化可以通过亲代细胞遗传给子代细胞，也可以在细胞中从头合成。甲基化程度作为一种可逆的DNA修饰方式，参与基因表达的调控，异常的高甲基化或低甲基化会引起各种疾病，所以可以作为细胞和生物体健康的检测标准。

通过结合基因组DNA的亚硫酸氢盐转化技术和高通量测序技术，可以对基因组的甲基化进行测序。简化代表性甲基化测序通过使用对甲基化不敏感的酶富集CpG岛区域，再通过亚硫酸氢盐转化、测序，可以实现单碱基检测的高分辨率和测序数据的高利用率。

基于甲基化信号的高灵敏、位点多、有组织特异性等特点，在临床实践中可以广泛应用于癌症早筛、疗效监控、组织溯源等领域。在临床实践中，石蜡包埋是一种常见的保存组织样本的手段，可以长时间保存组织细胞的形态特征，便于病理诊断。然而，福尔马林浸泡过程中，对细胞核中基因组DNA的损伤较大，造成提取出的基因组DNA有较多断裂的小片段，这些断裂的基因组DNA连接接头、进入文库，造成了大量的数据浪费，稀释了酶切对于CpG岛的富集作用。所以，利用传统RRBS构建FFPE DNA文库失败率较高，给甲基化测序技术在临床上的发展和推广带来了阻碍。市场需要一种能够阻碍基因组DNA与甲基化接头的连接，使酶切富集CpG岛区域的效果得到放大的同时，通过使用相同的缓冲液，使操作流程简单，减少试剂和人员成本，减少反复纯化造成的DNA损失，并且容易转化成自动化建库流程的技术，本发明解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法，本发明通过DNA末端修饰加双脱氧ATP（ddATP）以阻止非酶切DNA片段与后续甲基化接头连接，从而能够解决福尔马林浸泡造成的RRBS构建FFPE DNA文库失败率高的问题。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法，包括如下步骤：

步骤一，取石蜡包埋的组织样本，获得基因组DNA；用末端修饰酶对基因组DNA的末端进行加ddATP修复；

步骤二，采用限制性内切酶消化基因组DNA；

步骤三，用末端修饰酶对基因组DNA进行末端修复并在3’端加A-Tailing，将dATP掺入平末端DNA片段的3’端；

步骤四，用DNA连接酶对DNA进行甲基化接头连接，再将各个标签序列标记的样本混合；

步骤五，采用亚硫酸氢盐转化非甲基化胞嘧啶，转化后的DNA立即进行聚合酶链式反应扩增或保存于-80℃下；

步骤六，甲基化文库 PCR富集；