[发明专利]一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法

权利要求书

1.一种利用福尔马林固定石蜡包埋样本快速构建RRBS测序文库的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，取石蜡包埋的肠癌或肺癌组织样本，获得基因组DNA；用末端修饰酶对基因组DNA的末端进行加ddATP修复：

1）每个样本取15ng FFPE DNA，然后用水补齐到17µl，加到96孔板中，按照如下反应体系进行DNA末端修饰反应：DNA 17µl，Klenow Exo- 0.5µl，1mM ddATP 0.5µl，10X CutSmartbuffer 2µl；

2）在每个样本孔中加入3µl的DNA末端修饰反应混合物；

3）通过轻轻震荡来混合反应体系，并短暂离心；

4）将样本放入热循环仪中，热盖温度设为85℃，按照以下程序进行孵育反应：程序1 30℃10分钟；程序2 37℃10分钟；程序3 70℃5分钟；程序4 4℃hold；

5）孵育结束后，离心30秒；

步骤二，采用限制性内切酶消化基因组DNA：

1）按照如下反应体系进行限制性内切酶消化反应：上步产物20µl，MspI 0.5µl，10XCutSmart 0.1µl，水0.4µl；

2）在每个样本孔中加入1µl消化混合物；

3）通过轻轻震荡来混合反应体系，并短暂离心；

4）将样本放入热循环仪中，热盖温度设为85℃，按照以下程序进行孵育反应：程序1 37℃30分钟；程序2 75℃10分钟；程序3 4℃hold；

5）孵育结束后，离心30秒；

步骤三，用末端修饰酶对基因组DNA进行末端修复并在3’端加A-Tailing，将dATP掺入平末端DNA片段的3’端：

1）按照如下反应体系进行末端修复反应：

上步产物21µl，KlenowExo- 0.5µl，dNTP 0.4µl，10X CutSmart 0.2µl，水0.9µl；其中dNTP由10mM dATP，1mM dCTP，1mM dGTP 组成；

2）在每个样本孔中加入2µl末端修复混合物；

3）通过轻轻震荡来混合反应体系，并短暂离心；

4）将样本放入热循环仪中，热盖温度设为85℃，按照以下程序进行孵育反应：程序1 30℃10分钟；程序2 37℃10分钟；程序3 70℃5分钟，程序4 4℃hold；

5）孵育结束后，离心30秒；

步骤四，用DNA连接酶对DNA进行甲基化接头连接，再将各个标签序列标记的样本混合：

1）按照如下反应体系进行接头连接反应：上步产物23µl，100mM ATP 0.1µl，T4连接酶0.2µl，10X CutSmart buffer 0.3µl，0.15µM甲基化接头 2.4µl；

甲基化接头购买合成后，使用lowTE缓冲液溶解至100µM作为母液储存，再取部分母液稀释至0.15µM的工作液；

2）通过轻轻震荡来混合反应体系，并短暂离心；

3）将样本放入热循环仪中，热盖温度设为25℃，按照以下程序进行孵育反应：程序1 16℃1-3小时；程序2 70℃10分钟；程序3 4℃hold；

4）孵育结束后，离心30秒；

5）将24个不同标签序列标记的样本全部转移到一个1.5ml离心管中混合，然后用30µllowTE缓冲液洗涤每个样本孔，并最终与样本混合；

6）在每个混合的样本文库中加入1.8倍的VAHTS DNA Clean Beads磁珠，在室温下旋转试管30分钟，以促进磁珠和文库DNA的结合；

7）短暂离心样本管，将样本管置于DynaMagTM-2磁力架上分离磁珠，室温分离10分钟，小心取出上清溶液，注意不要碰到磁珠；

8）用1毫升80％新鲜配制的乙醇清洗磁珠两次；

待乙醇完全挥发后，用40μl lowTE缓冲液洗脱文库DNA；

步骤五，采用亚硫酸氢盐转化非甲基化胞嘧啶，转化后的DNA立即进行聚合酶链式反应扩增或保存于-80℃下：

1）根据QIAGENEpiTect快速亚硫酸氢盐转换试剂盒的产品说明书进行甲基化处理，使用了两个周期的亚硫酸氢盐转化方案，程序如下所示：程序1 98℃5分钟；程序2 60℃20分钟；程序3 98℃5分钟，程序4 60℃20分钟，程序5 20℃hold；

当热循环仪温度降至20℃后，应尽快进入试剂盒的纯化步骤以减少DNA损失；

2）用30µl的TE缓冲液洗脱转化完成的DNA；亚硫酸氢盐转化后的DNA应立即进行聚合酶链式反应扩增或保存于-80℃下；

步骤六，甲基化文库PCR富集；

步骤七，通过凝胶电泳对每一个混合样本中的条带在170-400bp的DNA片段进行切胶回收，再对切胶回收的文库进行质控和混合，最后进行Illumina平台测序，测序上样量按照常规Illumina文库的60％密度进行簇生成；其中，将DNA文库在4％agarose TAE-gel琼脂糖凝胶上电泳2小时，在1：10000稀释的SYBR Green I中染色1小时；根据DNA ladder切胶回收170-400bp的DNA片段；用QIAGEN MinElute凝胶纯化试剂盒纯化170-400bp的DNA片段，去除包含PCR引物序列、引物二聚体和大片段序列的非目标序列；

所述步骤四中的甲基化接头包括：RRBS-1，RRBS-2，RRBS-3，RRBS-4，RRBS-5，RRBS-6，RRBS-7，RRBS-8，RRBS-9，RRBS-10，RRBS-11，RRBS-12；RRBS-1的上游序列如SEQ01，下游序列如SEQ13；RRBS-2的上游序列如SEQ02，下游序列如SEQ14；RRBS-3的上游序列如SEQ03，下游序列如SEQ15；RRBS-4的上游序列如SEQ04，下游序列如SEQ16；RRBS-5的上游序列如SEQ05，下游序列如SEQ17；RRBS-6的上游序列如SEQ06，下游序列如SEQ18；RRBS-7的上游序列如SEQ07，下游序列如SEQ19；RRBS-8的上游序列如SEQ08，下游序列如SEQ20；RRBS-9的上游序列如SEQ09，下游序列如SEQ21；RRBS-9的上游序列如SEQ10，下游序列如SEQ22；RRBS-10的上游序列如SEQ11，下游序列如SEQ23；RRBS-11的上游序列如SEQ12，下游序列如SEQ24；

所述步骤一中的石蜡包埋的组织样本为石蜡包埋18个月以内的组织样本；

所述步骤六中的甲基化文库PCR富集的具体方法包括：在对文库富集前，取部分亚硫酸氢盐转化后的文库进行PCR循环数优化；将得到的PCR反应混合物分别分配到各个PCR孔中，离心PCR板孔，进行后续PCR扩增，从10个PCR循环数开始，依次递增2个循环至确立可以获得可靠文库的最适循环数；再将剩余的亚硫酸氢盐转化后的文库根据最适循环数进行扩增，纯化，洗脱文库DNA；

所述步骤六中的甲基化文库PCR富集的扩增引物包括：Universal Primer SEQ25，RRBS-R701 SEQ26，RRBS-R702 SEQ27，RRBS-R703 SEQ28，RRBS-R704 SEQ29，RRBS-R705SEQ30和RRBS-R706 SEQ31。