[发明专利]一种等温扩增技术结合核酸外切酶介导的可视化核酸检测方法

说明书

本发明提供了一种等温扩增技术结合核酸外切酶介导的可视化核酸检测方法，利用等温扩增技术扩增待检测核酸，Exo III剪切扩增子3’末端序列暴露单链DNA靶标，茎环探针结合靶标，Exo III能够剪切探针3’末端并释放荧光基团，通过裸眼或横向流动试纸条可快速、灵敏地检测病毒核酸。该方法无需特殊检测装置，检测速度快、灵敏性高、成本低，且在室温条件下均可完成检测，裸眼和试纸条可视化过程在25~30 min内完成，检测灵敏度可达到2个拷贝。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种等温扩增技术结合核酸外切酶介导的可视化核酸检测方法。

背景技术

核酸分子的快速检测对于疾病诊断、临床检验等都具有十分重要的作用。其广泛的应用领域也对核酸检测技术的发展不断提出新的需求，尤其是对现场化、快速化、简便化和准确性等方面的需求不断提升。传统的核酸检测方式主要包括通过RT-qPCR，但是这种方法需要借助荧光定量PCR仪。RPA-exo和Nfo-exo方法虽然能用于快速检测病毒核酸，但是该方法需要利用荧光读取仪器实时监控荧光强度来判别，且探针序列较长，需要修饰四个荧光基团，不仅增加成本，降低灵敏性，还限制了该方法在现场化的应用。Exo III结合茎环探针的方法虽然已经被广泛利用于核酸检测，但是该系统常常用来检测合成的靶标序列，或需要借助电化学材料或结合纳米材料来增强荧光信号，且尚未开发可视化检测方法。以上这些方法都不利于实时快速诊断和现场化检测的应用。因此，开发一种检测低成本、速度快、准确性高、灵敏度高、最小设备需求且能够应用于现场化检测的方法显得尤为重要。

发明内容

本发明目的在于提供一种简单、快速、准确、灵敏、设备最少、可应用于现场的核酸可视化检测方法。该方法是将RPA技术与核酸外切酶III结合，加之茎环探针完成的核酸检测技术，具体地，茎环探针结合在RPA扩增产物5’端后，Exo III切割茎环探针上的淬灭基团来释放荧光基团，通过裸眼和试纸条可视化方式进行病毒核酸的检测。本发明优化了检测体系和可视化方法，并快速、准确地鉴定到非洲猪瘟临床样本。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

基于等温扩增技术结合核酸外切酶介导的可视化核酸检测方法，包括以下步骤：

(1)等温扩增引物扩增待检核酸；

(2)核酸外切酶III剪切扩增子的3’平末端碱基，暴露茎环探针结合的单链DNA；

(3)标记荧光基团的探针与靶标结合，核酸外切酶III剪切探针的3’端，释放荧光基团用于裸眼检测和横向流动试纸条检测。

用于裸眼检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，包括非洲猪瘟病毒p72基因的等温扩增引物，特异性结合p72基因的茎环探针，核酸外切酶III；所述茎环探针的核苷酸序列为5’-AATATCACCTATATCTGATATTAGCCCCG-3’，茎环探针含有5’端标记的荧光基团和中间标记的淬灭基团。

进一步地，所述非洲猪瘟病毒p72基因的等温扩增引物的序列为：P72-F:5’-TAGGTAATGTGATCGGATACGTAACGG-3’；P72-R:5’-AACGCAGGTGACCCACACCAACAATAACC-3’。

进一步地，茎环探针最佳用量为10～20μM；核酸外切酶III反应最佳时间：37℃反应条件时，反应时间为5～20min；25℃反应条件时，反应时间为20～40min。

用于检测非洲猪瘟病毒的横向流动试纸条，包括非洲猪瘟病毒p72基因的等温扩增引物，特异性结合p72基因的茎环探针，核酸外切酶III，单链结合蛋白，横向流动试纸条；所述茎环探针的核苷酸序列为5’-AATATCACCTATATCTGATATTAGCCCCG-3’，茎环探针有两种标记方式，一种是茎环上标记FAM荧光基团，3’端标记生物素，另一种是茎环上标记生物素，3’端标记荧光基团。

进一步地，处于茎环上的第12位碱基T标记荧光基团或者生物素。