[发明专利]一种等温扩增技术结合核酸外切酶介导的可视化核酸检测方法

权利要求书

1.基于等温扩增技术结合核酸外切酶介导的可视化核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)等温扩增引物扩增待检核酸；

(2)核酸外切酶III剪切扩增子的3’平末端碱基，暴露茎环探针结合的单链DNA；

(3)标记荧光基团的探针与靶标结合，核酸外切酶III剪切探针的3’端，释放荧光基团用于裸眼检测和横向流动试纸条检测。

2.用于裸眼检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，包括非洲猪瘟病毒p72基因的等温扩增引物，特异性结合p72基因的茎环探针，核酸外切酶III；所述茎环探针的核苷酸序列为5’-AATATCACCTATATCTGATATTAGCCCCG-3’，茎环探针含有5’端标记的荧光基团和中间标记的淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒p72基因的等温扩增引物的序列为：P72-F:5’-TAGGTAATGTGATCGGATACGTAACGG-3’；P72-R:5’-AACGCAGGTGACCCACACCAACAATAACC-3’。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，茎环探针用量为10～20μM。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，核酸外切酶III反应时间：37℃反应条件时，反应时间为5～20min；25℃反应条件时，反应时间为20～40min。

6.用于检测非洲猪瘟病毒的横向流动试纸条，其特征在于，包括非洲猪瘟病毒p72基因的等温扩增引物，特异性结合p72基因的茎环探针，核酸外切酶III，单链结合蛋白，横向流动试纸条；所述茎环探针的核苷酸序列为5’-AATATCACCTATATCTGATATTAGCCCCG-3’，茎环探针有两种标记方式，一种是茎环上标记FAM荧光基团，3’端标记生物素，另一种是茎环上标记生物素，3’端标记荧光基团。

7.根据权利要求6所述的横向流动试纸条，其特征在于，处于茎环上的第12位碱基T标记荧光基团或者生物素。

8.根据权利要求7所述的横向流动试纸条，其特征在于，茎环探针用量为25～400nM。

9.根据权利要求7所述的横向流动试纸条，其特征在于，单链结合蛋白用量为2.5～50ng。