[发明专利]一种拟南芥高效遗传转化的方法

说明书

本发明提供一种拟南芥高效遗传转化的方法，通过构建质粒，转化农杆菌，然后收集菌体，浸泡拟南芥花序进行侵染后，将拟南芥植株放置黑暗处16‑24小时后，正常浇水培养，收获种子，再通过筛选标记直接筛选阳性种子，终止后得到阳性转基因植株。本发明不需要对农杆菌的单克隆进行检测，避免了农杆菌PCR的步骤；不需要液体培养农杆菌菌液，避免了液体培养过程和离心收集菌液的时间。本发明改进了拟南芥转化的步骤，节约了实验操作的时间，提高了拟南芥转化操作的工作效率，使得拟南芥转化操作可以规模化大批量进行。

技术领域

本发明涉及一种拟南芥高效遗传转化的方法，属于生物学领域。

背景技术

拟南芥由于其植株小、生命周期短、单株种子数量多、基因组已经完全解析等特点，已经成为植物科研领域广泛使用的模式植物。在拟南芥的研究中，科研工作者和生物技术服务公司需要构建大量的拟南芥转基因系。目前较为常用的拟南芥转化方法为农杆菌介导的花序侵染法。该方法的具体步骤为：（1）在大肠杆菌中完成载体构建和验证，得到构建好的质粒；（2）质粒转化农杆菌，涂平板后挑选单克隆进行验证，挑选阳性的单克隆；（3）挑取阳性单克隆于2mL抗性LB培养基中进行小量液体培养；（4）1:100接种到500mL抗性LB培养基中进行大量培养至对数生长期（OD值在0.6-0.8之间）；（5）离心获得大肠杆菌菌体，100mL转化液体(1/2 MS, 5%蔗糖)重新悬浮；（6）转化前加入0.02% 的Silwet-77于菌液中并转移菌液至烧杯中；（7）把拟南芥花序放入菌液中充分浸泡3-5分钟。（8）将浸过的植物用保鲜膜包裹，放置黑暗处16至24小时，以保持高湿度；（9）正常浇水，可用竹签固定植物，种子成熟时停止浇水。 （10）收获的种子于37℃烘箱干燥3-5天。（11）通过合适筛选标记筛选阳性苗。

本转化方法存在以下不足之处：（1）转化农杆菌后，需要挑选单克隆，耗时；（2）农杆菌由于其细胞壁较厚，质粒拷贝数低，普通菌液PCR比较困难。（3）挑选单克隆后，需要经过小量摇菌和大量摇菌这两个步骤，需要耗费3-4天的时间。（4）最终大量摇菌时候需要把握菌液的OD值情况以确保转化的菌体处在对数生长期内，繁琐耗时；（5）收集菌体需要离心，耗时费力，不适合一次转化较多建构的操作。

发明内容

针对以上问题，本发明提供一种更高效的农杆菌介导的拟南芥遗传转化方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

（1）采用Km抗性的空载体pDsRed0作为测试，所述Km抗性的空载体pDsRed0序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）采用1-2μg pDsRed0质粒转化100μL农杆菌感受态，转化后的所有菌液涂布到15cm直径的培养皿中，培养皿中含有50mg/L Km抗性和25mg/L Rif抗性的LB培养基；

（3）培养皿放置28℃生长3-4天，克隆长到2-3mm大小时，直接用涂布棒收集菌体；

（4）将收集的菌体用100mL转化液体重新悬浮，获得悬浮液，所述转化液体为含有5%蔗糖的1/2 MS培养基；

（5）转化前加入终浓度为0.02%的Silwet-77于悬浮液中并转移菌液至烧杯中；

（6）人工气候室中土壤基质种植拟南芥至盛花期，转化之前剪掉已经长出的果荚；

（7）把拟南芥的花序放入悬浮液中充分浸泡3-5分钟；

（8）将浸过的拟南芥植株用保鲜膜包裹，放置黑暗处16-24小时，以保持高湿度；

（9）正常浇水，用竹签固定植物，种子成熟时停止浇水；

（10）收获的种子于37℃烘箱干燥3-5天；

（11）通过Ds-Red荧光挑选阳性种子，种植阳性种子得到转基因阳性植株。

本发明的优点在于：

（1）不需要对农杆菌的单克隆进行检测，避免了农杆菌PCR的步骤，节约了单克隆检测的时间；