[发明专利]一种人胎盘组织源蜕膜间充质干细胞的简易制备方法

说明书

本发明涉及一种人胎盘组织源蜕膜间充质干细胞的简易制备方法，属于生物学技术领域。该方法包括如下步骤：将胎盘的蜕膜组织剪下，用含2％双抗的生理盐水反复清洗后使用镊子剥离蜕膜组织，收集蜕膜组织并剪碎，使用0.1％的胶原蛋白酶进行消化，稀释消化后使用一次性使用输血器过滤网对细胞悬液进行过滤并收集，400g离心5分钟后弃上清，将细胞沉淀使用5％完全培养基重悬后，400g离心5分钟后弃上清，使用5％完全培养基重悬后种瓶培养。本发明采用一步消化法制备胎盘底蜕膜干细胞，在分离、培养过程中采用改良的制备方法和培养体系减少对细胞的伤害，短缩了操作时长，提高分离效率，缩短培养周期，提高干细胞的产量的同时获得高纯度、表征优良的细胞。

技术领域

本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种人胎盘组织源蜕膜间充质干细胞的简易制备方法。

背景技术

干细胞是具有多能性维持和分化潜能的细胞。间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSC)是一种多能的成体干细胞，存在于胎盘、脐带、骨髓和脂肪组织等多种组织中，其有一定的分化潜能，可以分泌多种营养因子利于组织重塑和免疫调节，这些特性使得间充质干细胞成为治疗各种先天性和后天性疾病的出色候选者。胎盘在胎儿发育过程中起重要作用，从胎盘蜕膜获得的细胞，具有间充质干细胞的基本特征，为胎盘蜕膜间充质干细胞，其作为一个母亲自体间充质干细胞的重要来源，能安全的用于治疗多种疾病。有研究表面母体组织来源的间充质干细胞高水平分泌血管内皮生长因子和血管生成素1，增加血管通透性，促进内皮细胞的增殖和新生血管的生成，治疗后肢缺血疾病比其他来源的间充质干细胞更具有优势。

胎盘蜕膜间充质干细胞具有广阔的临床应用潜能，其制备主要采用酶消化方法。剥离蜕膜组织并剪成碎块，使用胶原蛋白酶消化后收集细胞沉淀并接种至培养瓶中进行扩增培养。该方法在组织剪切和消化过程中会破坏大量细胞，释放的染色体会导致消化液变得粘稠，且其中含有未被完全消化的组织，若将细胞悬液进行接种使得细胞培养环境中含有大量DNA及组织块会干扰细胞贴壁和生长。因此需要将消化液进行过滤，使用细胞筛网过滤时，未消化完全的组织块及粘稠的消化液常阻塞细胞筛网，导致过滤时间长，容易导致获得的细胞活力降低、增殖慢，且期间需更换新的细胞筛网才能完成消化液的过滤，增加生产成本。使用消化法提取底蜕膜间充质干细胞，原代细胞中含有大量的杂细胞，培养过程中需进行换液及传代来纯化细胞，原代细胞贴壁不牢容易在换液时脱落，为获取足够的种子细胞，则会增加换液次数延长培养时间，增加生产成本，不利于工业化生产。原代间充质干细胞获取的数量直接决定了通过传代培养获取的高代次细胞的数量。因此，研究提高人胎盘组织源蜕膜干细胞产量的制备方法，在原代细胞换液时减少细胞脱落，最大化收获蜕膜中的间充质干细胞具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中胎盘蜕膜间充质干细胞的分离培养步骤繁琐，操作时间长及成本高的问题，本发明提供一种操作简便、节约成本的同时确保获得高纯度、表征优良的胎盘蜕膜间充质干细胞，应用前景广阔。

本发明的上述目的是通过以下的技术方案得到实现：

本发明提供的提高胎盘蜕膜组织中原代间充质干细胞产量的制备方法，包括如下步骤：

(1)从胎盘样本剪下底蜕膜组织，放入150mm无菌培养皿中，使用含2％双抗的生理盐水漂洗5～6遍，洗净后使用镊子剥离靠母体侧的底蜕膜组织。

(2)收集底蜕膜组织并剪成单个体积为1～2mm³的肉糜，加入0.1％浓度的胶原蛋白酶并放入恒温震荡仪中37℃，200rmp消化30min。

(3)消化完成后加入3倍的生理盐水进行稀释消化，得到胎盘组织消化液。

(4)取一次性使用输血器，使用无菌剪刀将输液器的滴斗部位剪开，用于加入胎盘蜕膜组织消化液，将连接滴斗及过滤网的导管则剪剩3～4cm，使用止血钳夹住导管旁位置，放置在50mL离心管上固定。