[发明专利]一种人胎盘组织源蜕膜间充质干细胞的简易制备方法

权利要求书

1.一种人胎盘组织源蜕膜间充质干细胞的简易制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)从胎盘样本剪下底蜕膜组织，放入150mm无菌培养皿中，使用含2％双抗的生理盐水漂洗5～6遍，洗净后使用镊子剥离靠母体侧的底蜕膜组织。

(2)收集底蜕膜组织并剪成单个体积为1～2mm³的肉糜，加入0.1％的胶原蛋白酶并放入恒温震荡仪中37℃，200rmp消化30min。

(3)消化完成后加入3倍的生理盐水进行稀释消化，得到胎盘组织消化液。

(4)取一次性使用输血器，使用无菌剪刀将输液器的滴斗部位剪开，用于加入胎盘蜕膜组织消化液，将连接滴斗及过滤网的导管则剪剩3～4cm，使用止血钳夹住导管旁位置，放置在50mL离心管上固定。

(5)将新鲜的胎盘组织消化液加入到输液器的滴斗中，收集滤液，400g离心5min后倒弃上清后得到细胞沉淀。

(6)将细胞沉淀使用10～20mL 5％的完全培养基进行重悬并混匀，400g离心5min后倒弃上清后得到细胞沉淀。

(7)将细胞沉淀使用5％的完全培养基进行重悬后种瓶，放入37℃，5％CO₂培养箱中进行培养。

(8)待细胞生长至融合度达80～90％时，收集P0代细胞使用5％完全培养基重悬后按1∶4进行传代培养。

2.通过权利要求1所述的过滤方法，其特征在于，所述的过滤网为网口宽度为16mm，过滤网长度为45mm的袋式过滤网，过滤孔径为(200±20)um。

3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(2)中的0.1％胶原蛋白酶是使用α-MEM基础培养基配置，组织消化时加入蛋白胶原酶的体积是蜕膜组织量的4～5倍。

4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(7)中的种瓶培养应根据剥离的蜕膜组织量，5mL的蜕膜组织消化后收集的细胞沉淀可种瓶5～7个T-75细胞培养瓶。

5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于所述5％完全培养基为含5％人血小板裂解液的α-MEM培养基。

6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(7)中培养开始后24～36h进行全量换液，继续培养，所述继续培养则为每2～3天进行全量换液，培养全过程换液次数为1～2次，原代细胞培养天数为4～7天。

7.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述的换液使用的是5％完全培养基，并加入1％双抗及0.1％的两性霉素防止细胞污染。

8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，当细胞传代至P1时进行表面抗原检测及成软骨、成骨和成脂诱导。