[发明专利]一种构建高检测性能捕获文库的方法和试剂盒

说明书

本发明涉及一种构建适用于二代测序平台的捕获文库的方法，包括以下步骤：（1）获得片段化的DNA；（2）将片段化的DNA与Y型接头连接，获得预文库；（3）预文库与探针进行杂交，获得杂交产物；和（4）杂交产物洗脱，获得捕获文库。本发明还涉及用于实施上述方法的试剂盒。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及构建杂交捕获文库的方法和试剂盒。

背景技术

外显子捕获是利用探针捕获并富集外显子区域的DNA序列的技术，在科研和临床检测领域被广泛应用。与全基因组测序相比，其费用更低、周期更短、覆盖度更好、更加经济、高效。传统的外显子捕获文库的构建一般包括以下步骤：将基因组DNA片段化，进行末端修复和末端加A，然后连接接头和标签序列，并通过第一轮PCR扩增获得预文库；将预文库与杂交探针进行杂交，纯化后通过第二轮PCR扩增以获得最终的捕获文库（参见图1：传统外显子捕获流程示意图）。

通过PCR反应实现DNA富集是二代测序技术（Next-generation sequencing，NGS）领域的常用技术。PCR应用于外显子捕获，在实现了捕获产物扩增，得到上机所需的文库量的同时，也带来了扩增错误与偏好性，不能对原始基因组序列进行完美呈现。例如对某些特点的DNA优势扩增，造成DNA无法实现均衡扩增，进而造成捕获数据对目标区域的覆盖不均一，最终造成检测错误或漏检。PCR-Free技术的应用可以完美地规避以上不足，并且省去扩增等步骤，精简了实验流程且降低建库成本。传统的PCR-Free技术更多的被应用于片段化的DNA与接头连接后直接上机测序。由于PCR-Free技术对DNA模板投入要求较高，且探针捕获流程要考虑到捕获效率问题，故会造成DNA模板的大量浪费。目前普遍涵盖探针捕获实验方法的流程中，起始的DNA投入量需高达500ng-3μg之大，且在探针捕获步骤前后都要涉及PCR扩增。在本发明前，发明人通过进行技术优化，实现了低DNA起使量条件下，捕获前无PCR反应（参见图2：本实验室优化后外显子捕获流程示意图），但依然尚未解决杂交捕获后仍需PCR扩增的问题。

因此，仍需要建立一种简单经济、可以规避扩增错误与偏好性、实现检测性能的提升与有效的数据利用率，且能实现微量DNA投入的PCR-Free杂交捕获流程。

发明内容

鉴于对捕获数据性能检测的更高追求，对进一步节约成本和简化文库构建流程的要求，发明人在在先发明（专利申请公布文本CN110409001A中已描述，在此通过全文引用并入本文），即捕获前无需PCR的基础上，提出了一种捕获前后均无需PCR扩增的捕获文库构建方法（参见图3：本发明全建库流程PCR-Free文库构建方法流程示意图）。

本发明是基于发明人发现的以下事实：

（1）使用无捕获前PCR的原发明实验流程，将捕获后PCR循环数减少，Indel的检测性能显著提高。进而想到若能完全去掉PCR，能否达到最优的检测性能。

（2）理论计算的50-100ng DNA起使，且捕获前后无PCR时，杂交捕获的文库总量够上机。

（3）连接长Y型接头的预文库，杂交捕获得到的单链DNA已具备上机所需全部序列。

（4）低浓度的双链DNA文库在碱变性并进行中和反应后，可以在-20℃稳定保存十天以上，单链文库稳定性可满足上机要求。

（5）碱变性可以打开探针与杂交产物的DNA双链、Cot-1与杂交产物的DNA双链，也可以打开链霉亲和素与生物素的连接。碱变性处理后，大量带有生物素标记的探针、Cot-1和未成功连接的接头序列都会残留到文库中，在后续上机过程中会带来哪些影响是不确定的。发明人通过实验发现，这些残留探针并不会影响测序数据质量。

因此，在第一个方面，本发明提供一种构建适用于二代测序平台的捕获文库的方法，包括以下步骤：

（1）获得片段化的DNA；