[发明专利]一种利用LAMP技术快速检测金黄色葡萄球菌的引物组、检测方法、试剂盒及应用

说明书

本发明属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种利用LAMP技术快速检测金黄色葡萄球菌的引物组、检测方法、试剂盒及应用。本发明选用金黄色葡萄球菌毒力基因spA作为其特异性靶标，设计了4条能在62‑68℃下扩增该基因的特异性引物组，通过可视化染料指示检测结果，由紫罗兰色(阴性)变为天蓝色(阳性)，该方法检测金黄色葡萄球菌其特异性好、操作简单，无需昂贵仪器，且灵敏度比常规PCR高。本发明试剂盒可以快速(1小时内)特异地检测金黄色葡萄球菌，检测限是10^‑6ng/μL。其操作简单、结果易于判读，适合进出口检疫、食品卫生及临床样本检测。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种利用LAMP技术快速检测金黄色葡萄球菌的引物组、检测方法、试剂盒及应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种常见的食源性致病菌。金黄色葡萄球菌代谢类型为需氧或兼性厌氧，对环境要求不高，37℃为最适生长温度，但在各种恶劣环境中仍能存活，可耐高盐，最高可以耐受15％浓度的NaCl溶液，且对高温有一定的耐受能力，在80℃以上的高温环境下可存活30min以上。金黄色葡萄球菌在适当条件下可产生肠毒素，引起食物中毒。近几年，金黄色葡萄球菌引发的食物中毒报道层出不穷，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性微生物食物中毒事件的25％左右，每年近十万人感染此病菌，成为仅次于沙门氏菌和副溶血杆菌的第三大微生物致病菌。对食品中金黄色葡萄球菌进行精准检测是保障食品安全和指导细菌治疗的重要手段。

目前针对食源性致病菌的检测主要有培养鉴定法、酶联免疫吸附法、PCR分析法。细菌培养法是病原菌检测金标准，但需4-7天出结果，操作繁琐、耗时费力，在敏感性与特异性方面存在局限性，只能检测活细菌，且需要熟练的操作经验；酶联免疫吸附法(ELISA)在特异性方面较好，但需要依赖于酶标仪等专业设备。各种PCR技术主要通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察或者荧光曲线等分析病原菌，检测敏感、准确、迅速，但仍依赖昂贵的PCR仪，检测成本较高，对实验技术要求较高，难以胜任现场化便携式快速检测。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种简单、高效、特异、实用的快速检测金黄色葡萄球菌检测方法，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种利用LAMP技术快速检测金黄色葡萄球菌的引物组，引物序列如下：

spA-F3:AAGATGGCAACAAGCCTG；

spA-B3:TGTTAGCATCTGCATGGT；

spA-FIP:CCGTTTGCTTTTGCAATGTCAGCAACGGAGTACATGTCG；

spA-BIP:CACTACTGCTGACAAAATTGCTGCAACAACAAGTTCTTGACCAG。

本发明还提供了一种快速检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，包括：2×LAMP反应缓冲液、Bst 2.0Warmstart DNA聚合酶、20×Eva Green、120μM羟基溴酚蓝、上述的引物组。

进一步地，所述2×LAMP反应缓冲液包括：40mM Tris，20mM KCl，16mM MgSO₄，20mM(NH₄)₂SO₄，0.2％Tween-20，2.8mM dNTPs，1M甜菜碱，pH 8.8。

进一步地，还包括：阳性对照样品金黄色葡萄球菌ATCC12600、标准菌株ATCC13076、标准菌株ATCC14028、标准菌株D68-4、插入了金黄色葡萄球菌spA基因的PUC57载体质粒中的至少一种。

进一步地，外引物spA-F3和spA-B3与内引物spA-FIP和spA-BIP的浓度比例为8:1。