[发明专利]一种闪电克隆用反应混合试剂及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及分子克隆技术领域，具体是公开了一种闪电克隆用反应混合试剂及其制备方法和应用，一种闪电克隆用反应混合试剂，包括具有核酸外切功能的同源重组酶、DNA连接酶和反应缓冲液；以总体系为20uL计，同源重组酶的用量是0.06uL‑0.18uL，DNA连接酶的用量是0.03uL‑0.15uL/总反应体系，余量为反应缓冲液；所述反应缓冲液中各组分的质量百分比为：Tris‑HCl 10‑16％、MgCl₂18‑26％、K₃P 5‑15％、KCl 3‑9％、NaCl 10‑18％、二硫苏糖醇8‑12％、甘油15‑30％。本发明克服了现有技术的不足，采用同源重组酶将外源基因克隆至载体靶位点，本反应混合试剂的准确率更高，更为简单，使用方便，更为快速，且具有更高的克隆效率和稳定性。

技术领域

本发明涉及分子克隆技术领域，具体属于一种闪电克隆用反应混合试剂及其制备方法和应用。

背景技术

DNA克隆和亚克隆以当今生物技术产业和分子生物学为基础，如今市场上将若干个DNA片段连接起来以及将目的片段克隆到目标载体靶位点的需求一直持续不断，传统的将外源基因导入载体靶位点中的方法通常包括以下几个步骤：(1)首先要用一种或多种限制性内切酶将载体进行酶切，将载体线性化；(2)用碱性磷酸酶处理线性载体防止连接过程中载体的重新环化；(3)利用引物进行外源DNA的PCR扩增反应；(4)利用同样的限制性外切酶处理扩增后的外源DNA产物并纯化；(5)将载体与外源DNA连接；(6)将连接产物转化到受体细胞中，比如大肠杆菌，并筛选出包含目的DNA片段的重组子。传统的克隆方法繁琐费时，克隆效率相对较低，并且受限于载体和外源基因上的的限制性酶切位点。

当前各种组装的方法层出不穷，各有优缺点和最适合的领域，但目前体外组装方法要么整体价格偏贵要么效率不够高，不适合大规模的推广使用。伴随着合成生物学领域的发展，对克隆技术提出了更高的要求，精确、高效、简便和经济的克隆方法更有利于合成生物学的发展。

发明内容

本发明的目的是提供了一种闪电克隆用反应混合试剂及其制备方法和应用，克服了现有技术的不足，采用同源重组酶将外源基因克隆至载体靶位点，本反应混合试剂的准确率更高，更为简单，使用方便，更为快速，且具有更高的克隆效率和稳定性。

为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：

一种闪电克隆用反应混合试剂，包括具有核酸外切功能的同源重组酶、DNA连接酶和反应缓冲液；

以总体系为20uL计，同源重组酶的用量是0.06uL-0.18uL/总反应体系，DNA连接酶的用量是0.03uL-0.15uL/总反应体系，余量为反应缓冲液。

进一步，所述反应缓冲液中各组分的质量百分比为：Tris-HCl 10-16％、MgCl₂18-26％、K₃P 5-15％、KCl 3-9％、NaCl 10-18％、二硫苏糖醇8-12％、甘油15-30％。

进一步，所述反应混合试剂中的各组分允许预先配置为3×、2×或5×浓度浓缩，为后期添加DNA做预留，且浓缩条件不影响组装反应的效果。

本发明还保护了一种闪电克隆用反应混合试剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)合成同源重组酶；

(2)制备反应缓冲液；

(3)分装同源重组酶、DNA连接酶和反应缓冲液。

进一步，所述同源重组酶的具体合成方法包括：

(1)合成重组酶的DNA序列以及和载体酶切位点相对应的碱基序列；

(2)用NcoI和XhoI对DNA片段进行酶切；

(3)酶切片段用T4 DNA连接酶连接；