[发明专利]一种闪电克隆用反应混合试剂及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种闪电克隆用反应混合试剂，其特征在于：包括具有核酸外切功能的同源重组酶、DNA连接酶和反应缓冲液；

以总体系为20uL计，同源重组酶的用量是0.06uL-0.18uL/总反应体系，DNA连接酶的用量是0.03uL-0.15uL/总反应体系，余量为反应缓冲液。

2.根据权利要求1所述的一种闪电克隆用反应混合试剂，其特征在于：所述反应缓冲液中各组分的质量百分比为：Tris-HCl 10-16％、MgCl₂18-26％、K₃P 5-15％、KCl 3-9％、NaCl10-18％、二硫苏糖醇8-12％、甘油15-30％。

3.根据权利要求1所述的一种闪电克隆用反应混合试剂，其特征在于：所述反应混合试剂中的各组分允许预先配置为3×、2×或5×浓度浓缩，为后期添加DNA做预留，且浓缩条件不影响组装反应的效果。

4.根据权利要求1所述的一种闪电克隆用反应混合试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)合成同源重组酶；

(2)制备反应缓冲液；

(3)分装同源重组酶、DNA连接酶和反应缓冲液。

5.根据权利要求4所述的一种闪电克隆用反应混合试剂的制备方法，其特征在于：所述同源重组酶的具体合成方法包括：

(1)合成重组酶的DNA序列以及和载体酶切位点相对应的碱基序列；

(2)用NcoI和XhoI对DNA片段进行酶切；

(3)酶切片段用T4 DNA连接酶连接；

(4)转化入大肠杆菌感受态细胞，在37℃条件下摇床40分钟表达；

(5)转化后的大肠杆菌表达以后，纯化得到同源重组酶。

6.根据权利要求5所述的一种闪电克隆用反应混合试剂的制备方法，其特征在于：所述DNA片段进行酶切的反应体系为：

在22℃条件下反应60分钟。

7.权利要求1所述闪电克隆用反应混合试剂在DNA重组闪电克隆中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述闪电克隆的方法是向含有线性载体和目的DNA片段的体系中加入具有核酸外切功能的同源重组酶，在冰上消化1min～3min，使两者产生具有同源序列的5’末端，然后在70～75℃下使酶失活，最后退火使线性载体和目的DNA片段重组形成带有缺刻的环形质粒，并转化到大肠杆菌中修复缺刻并随宿主基因组进行复制。