[发明专利]一株异源表达组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株及其构建与应用

说明书

本发明公开了一株异源表达组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株，命名为工程菌株E264::R‑tdp‑dep，其是利用Burkholderia thailandensis E264ΔoprABCΔtdpDE5kb为出发菌株，通过转座的方法在其基因组上整合了组合生物合成基因簇R‑tdp‑dep获得。本发明还公开了所述工程菌株在制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228中的应用。实验证实：本发明的工程菌株E264::R‑tdp‑dep产FK228的量达到了94mg/L，是目前FK228工业生产菌株的近5倍，极大地提升了FK228的产量且降低了发酵成本，缩短了发酵生产周期，为规模化制备和开发组蛋白去乙酰化酶抑制剂类药物奠定了基础，具有显著的经济价值和社会效益。

技术领域

本发明涉及一种生产组蛋白去乙酰化酶抑制剂的工程菌株及其构建与应用，尤其涉及一株异源表达组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株及其构建与发酵生产FK228的应用，属于生物合成技术领域。

背景技术

组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylases inhibitor,HDACi)可以阻碍组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)移除组蛋白N端赖氨酸残基上的乙酰基，使染色质维持一个更加开放的转录活性状态，从而可以调控沉默性肿瘤抑制基因的表达。FK228，又名 Romidepsin或Depsipeptide，最初是从日本土壤样品中的紫色色杆菌Chromobacterium violaceum中分离出来的。FK228作为一种高效的并具有选择性的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，具有非常好的抗肿瘤活性。由美国Gloucester Pharmaceuticals公司开发的FK228抗肿瘤药物制剂(注射液)Istodax，于2009年被美国FDA批准用于治疗外周及皮肤T-细胞淋巴瘤。

FK228的生物合成基因簇dep主要由三个非核糖体多肽合成酶基因(depA、depD和depE)、两个聚酮合成酶基因(depB和depC)、一个二硫键氧化还原酶基因(depH)和一个硫酯酶基因(tdpH)组成。目前产FK228的野生菌株Chromobacterium violaceum No.968产量相对有限(19mg/L)，同时其化学合成也被证明非常困难，缺乏能高效生产组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的方法及高产组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株异源表达组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株及其构建与发酵生产FK228的应用。

本发明所述异源表达组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株，其特征在于：该工程菌株命名为工程菌株E264::R-tdp-dep，其基因型为：Burkholderia thailandensisE264ΔoprABCΔtdpDE5kb,apramycin resistance,tdpR,tdpA,tdpB,tdpC1,tdp-depDE,tdpF,tdpG, tdpH,tdpI and tdpJ，是利用Burkholderia thailandensis E264ΔoprABCΔtdpDE5kb为出发菌株，通过转座的方法在其基因组上整合了组合生物合成基因簇R-tdp-dep获得。

上述异源表达组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株的构建方法，步骤是：

(1)利用ExoCET组装技术将合成的depD和depE基因三片段PartI、PartII、PartIII与载体pBR322-amp-ccdB片段进行组装，构建得到质粒pBR322-amp-ccdB-depD-depE；

(2)利用Red/ET同源重组技术，将km-ccdB片段替换质粒p15A-cm-tdp中的tdpDE基因，构建得到质粒p15A-cm-tdp-delDE-km-ccdB；