[发明专利]一株异源表达组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株及其构建与应用

权利要求书

1.一株异源表达组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株，其特征在于：该工程菌株命名为工程菌株E264::R-tdp-dep，其基因型为：Burkholderia thailandensis E264ΔoprABCΔtdpDE5kb,apramycin resistance,tdpR,tdpA,tdpB,tdpC1,tdp-depDE,tdpF,tdpG,tdpH,tdpI and tdpJ，是利用Burkholderia thailandensis E264ΔoprABCΔtdpDE5kb为出发菌株，通过转座的方法在其基因组上整合了组合生物合成基因簇R-tdp-dep获得。

2.权利要求1所述异源表达组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株的构建方法，步骤是：

(1)利用ExoCET组装技术将合成的depD和depE基因三片段PartI、PartII、PartIII与载体pBR322-amp-ccdB片段进行组装，构建得到质粒pBR322-amp-ccdB-depD-depE；

(2)利用Red/ET同源重组技术，将km-ccdB片段替换质粒p15A-cm-tdp中的tdpDE基因，构建得到质粒p15A-cm-tdp-delDE-km-ccdB；

(3)利用限制性内切酶PacI对步骤(1)构建的质粒pBR322-amp-ccdB-depD-depE进行酶切得到depDE线性片段，利用限制性内切酶BstZ171和BamHI对步骤(2)构建的质粒p15A-cm-tdp-delDE-km-ccdB进行双酶切释放载体p15A-cm-tdp-deltdpDE线性片段；然后两个线性片段在体外通过T4 DNA聚合酶进行处理，然后将其电转到E.coli GB2005中，得到质粒p15A-cm-tdp-dep；

(4)利用Red/ET同源重组技术，在步骤(3)构建的质粒p15A-cm-tdp-dep上插入km-ccdB用于敲除四环素启动子，得到质粒p15A-cm-dep-deltetR-km-ccdB；

(5)利用限制性内切酶BstZ171对质粒p15A-cm-dep-deltetR-km-ccdB进行酶切释放载体p15A-cm-dep-deltetR-km-ccdB线性片段；p15A-cm-dep-deltetR-km-ccdB线性片段与tdpR在体外通过T4 DNA聚合酶进行处理，然后将其电转到E.coli GB2005中，得到质粒p15A-cm-R-tdp-dep；

(6)在步骤(5)构建的质粒p15A-cm-R-tdp-dep中分别插入转座元件，构建得到表达质粒p15A-apra-tnpA-R-tdp-dep；

(7)将表达质粒p15A-apra-tnpA-R-tdp-dep电转至E.coli WM3064中，然后与Burkholderia thailandensis E264ΔoprABCΔtdpDE5kb进行结合转移，最终将组合生物合成基因簇R-tdp-dep整合到宿主染色体上，得到了能生产FK228的工程菌株，命名为工程菌株E264::R-tdp-dep。

3.权利要求1所述异源表达组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株在制备FK228中的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述异源表达组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株发酵制备FK228的方法是：

一级种子培养：保藏的种子E264::R-tdp-dep用接种环挑取一环划平板于固体LB培养基上，在37±1℃恒温培养箱中培养12±2h；

二级种子培养：用接种环挑取培养好的一级种子，接入装液量为50mL液体LB培养基的250mL摇瓶中，在37±1℃、180±20r·min^-1条件下培养16±2h；

发酵培养：将二级种子按体积比1％接种量接入装液量为65mL发酵培养基的250mL摇瓶中，在28±1℃、180±20r·min^-1的条件下培养12±2h；加入终浓度重量比4％的XAD-16大孔吸附树脂悬浮液，28±1℃、180±20r·min^-1的条件下继续培养38±2h，得到含FK228的发酵液；

所述含FK228的发酵液的分离方法是：

将含FK228的发酵液常规离心收集树脂和菌体，冷冻干燥；用二氯甲烷浸泡产物4±1h，抽滤分离浸提液，重复3±1次，合并浸提液，低压浓缩干燥获得粗提物；

用液相初步分离纯化：以超纯水为流动相A，以色谱纯乙腈为流动相B，梯度洗脱条件为0–5min 30％B,5–60min 30–80％B,8mL/min；收集流份，获得FK228粗品；

HPLC分离纯化：以超纯水为流动相A，以色谱纯乙腈为流动相B，梯度洗脱条件为0–5min5％B,5–60min 5–45％B,3mL/min，收集流份，低压浓缩干燥，获得FK228纯品。