[发明专利]一种子宫内膜类器官培养基及培养方法

说明书

本发明提供一种子宫内膜类器官培养基及培养方法，该培养基按照终浓度组成包括：10‑100ng/ml的EGF，20‑500ng/ml的Noggin，20‑500ng/ml的R‑spondin 1，20‑500ng/ml的Wnt3a，1‑100ng/ml的FGF9，10‑200ng/ml的KIAA1199，1‑100ng/ml的sox2，10‑100nM异黄酮，100‑2000nM的CHIR99021，1‑40μM的A83‑01，2‑50μM的ROCK抑制剂，50‑200ug/ml的原代细胞抗生素；以上成分均溶于DMEM/F12培养液中。将该培养基用于子宫内膜类器官培养，有利于子宫内膜干细胞的快速扩增以及类器官的成熟与分化，并且传代次数显著提高，多次传代后仍能维持原代组织同样的组织结构与基因组特性。

技术领域

本发明涉及类器官培养技术领域，具体涉及一种子宫内膜类器官培养基及培养方法。

背景技术

子宫内膜经历着动态发育的过程，在生殖过程中，子宫内膜的功能层在下丘脑-垂体-卵巢轴的控制下经历月经周期的再生、分化和脱落。粘膜包含单层腺体，由分泌柱状上皮排列，间质分隔。子宫内膜的基本功能是腔上皮和腺上皮，由纤毛和分泌细胞的混合物。管腔上皮是胚胎附着的部位，上皮覆盖在子宫内膜表面，从内膜向间质内陷形成腺体。腺分泌物中富含胎盘生长所必需的生长因子和脂质。

类器官(Organoids)是衍生于干细胞或前体细胞的器官特异性细胞集合。体外培养的类器官在细胞成分和组织架构上与对应器官高度相似，并具备相应的功能学特征。与常规细胞培养在二维环境中培养单一细胞类群不同，类器官培养是在三维环境中培养出特定组织器官包含的多种细胞类群，其培养体系与体内微环境更为相似。因此，在各种器官生理病理的基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗、再生医学等方面，显示出巨大的应用前景。

虽然多种人源其他组织(如肝脏、肠等)使用不同的方法、不同的培养条件下可在体外成功培养成功为类器官，但是目前关于子宫内膜类器官的培养方法的研究及报道较少，尤其是具体的试验流程、操作步骤、培养条件、及培养基配方尚无太多报道。

发明内容

针对目前国内子宫内膜类器官培养技术的空白，本发明提供一种子宫内膜类器官培养基及培养方法。本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种子宫内膜类器官培养基，按照终浓度组成包括：10-100ng/ml的EGF，20-500ng/ml的Noggin，20-500ng/ml的R-spondin 1，20-500ng/ml的Wnt3a，1-100ng/ml的FGF9，10-200ng/ml的KIAA1199，1-100ng/ml的sox2，10-100nM异黄酮，100-2000nM的CHIR99021，1-40μM的A83-01，2-50μM的ROCK抑制剂，50-200ug/ml的原代细胞抗生素；以上成分均溶于DMEM/F12培养液中。

优选地，所述培养基按照终浓度的组成包括：20-100ng/ml的EGF，100-400ng/ml的Noggin，100-400ng/ml的R-spondin 1，100-400ng/ml的Wnt3a，20-50ng/ml的FGF9，50-100ng/ml的KIAA1199，20-80ng/ml的sox2，20-80nM异黄酮，500-1000nM的CHIR99021，5-20μM的A83-01，5-20μM的RKI-1477，50-150ug/ml原代细胞抗生素。

可选地，上述培养基组成中，将FGF9替换为FGF10。

第二个方面，本发明提供一种子宫内膜类器官培养方法，是采用上述培养基，包括以下步骤：

步骤一，将获得的子宫内膜标本经过预处理得到细胞数量为3-50个细胞的细胞团；

步骤二，将细胞团与Matrigel基质胶混匀后铺板，待凝固后倒置固定20-30min；