[发明专利]提高胰高血糖素样肽六连体在毕赤酵母中表达水平的方法

说明书

本发明公开了提高胰高血糖素样肽六连体在毕赤酵母中表达水平的方法。本发明基于转录组测序分析毕赤酵母低水平表达菌株和高水平表达菌株的差异基因，筛选出一个转录水平差异显著的新基因GESE。本发明利用毕赤酵母CRISPR/Cas9基因敲除技术敲除毕赤酵母宿主中GESE基因后发现6×mGLP‑1在毕赤酵母菌株中的表达水平得到显著提高。由此，本发明提供了一种提高胰高血糖素样肽六连体在毕赤酵母中表达水平的方法，包括将宿主毕赤酵母菌株中的GESE基因敲除或进行突变。本发明还进一步提供了胰高血糖素样肽六连体酵母表达载体以及GESE基因编辑载体。本发明为提高外源蛋白基因在毕赤酵母中的表达水平提供基础研究和新途径。

技术领域

本发明涉及胰高血糖素样肽六连体的重组表达方法，尤其涉及提高胰高血糖素样肽六连体在毕赤酵母中表达水平或表达量的方法，属于胰高血糖素样肽六连体的重组表达领域。

背景技术

糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病，由胰岛素相对缺乏导致糖类代谢功能紊乱引起，肠源性激素胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)因其依赖葡萄糖浓度促进胰岛β细胞分泌胰岛素来降低血糖水平，不会造成严重低血糖而引起广泛关注，但由于其在血液中的半衰期只有几分钟，限制了GLP-1在医疗上的应用。胰高血糖素样肽六连体（6×mGLP-1）是在已有的研究基础上，分别对天然GLP-1分子内DPP-IV与Trypsin敏感位点的氨基酸残基进行替换(His⁷-Ala⁸突变为His⁷-Ser⁸/Gly⁸,Lys^26,34突变为Gln²⁶，Asn³⁴/Asp³⁴)、C末端添加Cys、首尾相连形成6个串联重复、C末端添加His-tag、密码子优化，并转化到毕赤酵母中，使其在毕赤酵母中分泌表达，但是其在毕赤酵母中表达水平低，使其生产和纯化的成本过高，不能满足工业生产的需求。

毕赤酵母是目前在工业生产重组蛋白中应用最为广泛一种酵母菌种，相对于其他表达系统，毕赤酵母表达系统具有可高密度发酵，操作简便快捷，同时作为真核生物又具备了原核生物所没有的特性，如蛋白的翻译后加工和修饰，包括二硫键形成、糖基化和脂酰化等。对于一些有细胞毒性的外源重组蛋白，可以将蛋白定位于毕赤酵母的过氧化物酶体中，既可以保证毕赤酵母不被毒性伤害，又可以防止蛋白酶对外源蛋白的降解，对于分泌到胞外的重组蛋白来说，由于毕赤酵母本身的分泌蛋白较少，在后期外源蛋白的分离和纯化可简化操作。极适合工业大规模发酵生产。但随着毕赤酵母表达系统的广泛应用发现，并不是所有外源蛋白基因均能在毕赤酵母中高效表达，传统方法如使用强启动子、密码子优化、增加拷贝数、基因的融合表达、优化发酵条件等对提高大多外源蛋白在毕赤酵母中的表达水平十分有限，甚至起不到作用。

由于6×mGLP-1在毕赤酵母中表达水平低，使其生产和纯化的成本过高，该缺陷严重限制了6×mGLP-1在医药上的广泛应用，亟待改进。

发明内容

本发明的目的之一是提供提高胰高血糖素样肽六连体（6×mGLP-1）在毕赤酵母中表达水平的方法；

本发明的目的之二是提供一种胰高血糖素样肽六连体基因酵母表达载体；

本发明的目的之三是提供一种GESE基因编辑载体。

本发明的目的之四是将胰高血糖素样肽六连体基因酵母表达载体以及GESE基因编辑载体应用于提高胰高血糖素样肽六连体（6×mGLP-1）在毕赤酵母中表达水平。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：