[发明专利]一种樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法

说明书

本发明公开了一种樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法，属于植物组织培养技术领域。该方法包括以下步骤：采集未成熟的果实作为外植体，经消毒后，切开果实，取出未成熟的合子胚；经体细胞胚和胚性愈伤组织的诱导培养，体细胞胚和胚性愈伤组织的增殖、成熟与萌发、体胚苗的繁育培养和生根培养得到种苗；体细胞胚和胚性愈伤组织的增殖、成熟与萌发是通过体胚增殖、成熟和萌发通用培养基在同一阶段实现樟树体细胞胚和胚性愈伤组织转化生成体胚苗。本发明提供的体胚增殖、成熟和萌发通用培养基可在3‑4个月实现樟树胚性愈伤组织转化生成体胚苗，约6个月便可获得大量生根樟树体胚苗，具有操作工序节省、效率高、使用简便的优点。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法。

背景技术

樟树(Cinnamomum camphora)属樟科(Lauraceae)樟属植物，又名香樟，常绿高大乔木，是我国国家二级重点保护野生植物。樟树是珍贵的阔叶树生物资源，对于全球的经济和生态系统都具有非常重要的作用。樟树是我国亚热带常绿阔叶林中重要组成树种，也是我国重要的材用和特种经济树种。樟木是我国四大名木之一，其木材质优，色泽明亮，纹理交错，兼具特殊的芳香气味，抗虫蛀，耐水湿，保存期长等优点，在家具，雕刻，建筑等领域的用材方面扮演着重要的角色。樟树富含精油，也是重要的香料工业原料林树种，其根、木材、枝、叶、及种子均可以提取樟油，是医药、日用化工及香精香料工业的原料。樟树枝叶繁茂、树形优美，能吸烟滞尘，固土防风是城市园林绿化的优良树种，广泛作为行道树、遮阴树及防风林等，其次樟树所散发的芳香性气味，有净化空气的能力，常被用于城市及矿区绿化。

植物体细胞胚胎发生(Somatic embryogenesis)是指在离体培养条件下，双倍或单倍的体细胞未经性细胞融合而通过与合子胚发生类似的途径发育成新植株的形态发生过程。体细胞胚胎发生是植物现代生物技术中一种无性繁殖的方法，能够用于珍稀种质资源的冷冻保存和基因编辑在内的遗传转化。现有技术从樟树体胚的诱导到体胚萌发通过5个阶段：(1)体胚的诱导；(2)体胚或胚性愈伤组织的增殖；(3)樟树体胚或胚性愈伤组织的成熟培养；(4)樟树体胚的萌发；(5)体胚的生根。目前，体细胞胚胎发生用于大规模繁育优质阔叶树种的实践应用关键步骤在于胚胎的成熟、萌发以及幼苗转换阶段。成熟的体细胞胚胎发生技术有繁殖系数高、速度快、结构完整、再生率高、不受季节限制，可发育成母本性状相同的植株等优点，现已成为林木无性快繁的一种重要生物技术手段。

在现有樟树体胚再生技术中：杜丽等(2006)以未成熟幼胚为外植体，经2年对初生胚的继代培养获得胚性愈伤组织，其MS培养基添加的植物外源激素为1.0mg/L BA、0.1mg/L2，4-D；将胚性愈伤组织转入培养基2[MS+1000mg/L ME(麦芽提取物)+1.0mg/LNAA，蔗糖30g/L，琼脂粉为7.5g/L]进行体胚诱导，6周之后将培养物转入促使其发育的培养基3(MS+0.1mg/L NAA+3.0mg/L BA+1mL/L Km-8p有机物)，4周之后将长大的体胚转入培养基4(MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L BA+1.0mg/L GA3)诱导不定芽的生长。培养4周之后将诱导出的不定芽切离母体转入培养基5(MS+0.1mg/L NAA+0.5mg/L BA+0.5mg/L GA3)诱导其生长，之后将茎切段(长度为2～3cm)转入培养基6(MS+1.0mg/L IBA)诱导生根，形成完整植株。培养温度为(24±2)℃，每天光照16h，光照强度为1000lx左右。

Shi等2009年对樟树体胚再生体系进行了优化：未成熟合子胚为外植体经蔗糖溶液高渗体细胞胚诱导3-4周获得初生胚；初生胚在含0.5mg/L NAA的MS培养基中以次生胚发生的方式快速增殖；次生胚难以萌发，需先用含0.5mg/L ABA的MS培养基进行成熟诱导2月，然后再转入萌发培养基(MS+0.1mg/L TDZ+0.2mg/L IBA)培养2个月获得体胚苗。

申请号为2019112839284公开了一种浙江樟体胚发生与植株再生方法，但其仍需经过上述几个阶段，过程复杂。