[发明专利]一种樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法

权利要求书

1.一种樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：采集未成熟的果实作为外植体，经消毒后，切开果实，取出未成熟的合子胚；经体细胞胚和胚性愈伤组织的诱导培养，体细胞胚和胚性愈伤组织的增殖、成熟与萌发、体胚苗的繁育培养和生根培养得到种苗；所述体细胞胚和胚性愈伤组织的增殖、成熟与萌发是通过体胚增殖、成熟与萌发通用培养基在同一阶段实现樟树体细胞胚和胚性愈伤组织转化生成体胚苗；

具体包括以下步骤：

1）外植体的采集与消毒：采集未成熟的果实作为外植体，经消毒后，切开果实，取出未成熟的合子胚；

2）体细胞胚和胚性愈伤组织的诱导培养：将消毒后的未成熟合子胚置于0.5 M蔗糖灭菌溶液，4℃冷处理72 h；然后接种于体胚诱导培养基，得到体细胞胚和胚性愈伤组织；所述体胚诱导培养基为：MS+6-苄基腺嘌呤 1 mg/L+2，4D-二氯苯氧乙酸 0.2 mg/L+水解酪蛋白600 mg/L+活性炭 0.6 g/L+蔗糖 30 g/L+卡拉胶 6.5g/L，pH值为6.0；

3）体细胞胚和胚性愈伤组织的增殖、成熟与萌发：将步骤2）得到的体细胞胚和胚性愈伤组织分别置于体胚增殖、成熟与萌发通用培养基上直至萌发出体胚苗；其中，胚性愈伤组织每隔2周接种一次实现胚性愈伤组织的保持与增殖，培养6-8周实现体胚的成熟诱导，并萌发出体胚苗；子叶期的体细胞胚每隔3周接种一次实现次生胚的增殖，培养6-8周萌发出体胚苗；所述体胚增殖、成熟与萌发通用培养基为：MS +6-苄基腺嘌呤 0.2 mg/L+噻苯隆0.1 mg/L+吲哚丁酸 0.2 mg/L+活性炭 0.6 g/L+蔗糖 30 g/L+卡拉胶 6.5g/L，pH值为6.0；

4）体胚苗繁育培养：将步骤3）得到的体胚苗置于芽增殖培养基上培养得到长势良好的不定芽，所述芽增殖培养基为：MS+ 6-苄基腺嘌呤 1.2 mg/L+噻苯隆 0.02 mg/L+萘乙酸0.2 mg/L+活性炭 0.6 g/L+蔗糖 30 g/L+卡拉胶 6.5g/L，pH值为6.0；

5）体胚苗的生根培养：将长势良好的不定芽置于生根培养基中诱导生根得到种苗，所述生根培养基为：1/2 MS+吲哚丁酸 2 mg/L+萘乙酸 0.1 mg/L+活性炭 0.6 g/L+蔗糖 30g/L+卡拉胶 6.5g/L， pH值为6.0；

步骤2）至步骤5）中，培养基的培养条件为：培养温度为25-26℃，光照强度1200lux，光照周期为12h光照/12h黑暗。

2.根据权利要求1所述的樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法，其特征在于，步骤1）所述的外植体的采集与消毒的步骤具体为：采集未成熟的果实作为外植体，自来水冲洗15-20 min后，移至超净工作台上；75%的酒精浸泡45秒，用无菌水冲洗2次，0.1%升汞消毒7分钟，无菌水冲洗4次后，切开果实，取出未成熟合子胚。

3.根据权利要求1所述的樟树体细胞胚胎发生与组织培养的方法，其特征在于，在获得种苗后进行炼苗移栽，将种苗室温条件下室内炼苗3-5天，洗净根部的培养基，移栽置灭菌后的蛭石：珍珠岩：泥炭土为1：1：1的基质中，罩上薄膜，2周后去膜，培养2个月后，移栽至大棚进行管理。