[发明专利]一种二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用。本发明通过对来自C.glutamicum XQ‑5的二氨基庚二酸脱氢酶进行突变，将36位Arg突变成Glu，酶以NADH为辅酶的活力大于以NADPH为辅酶的活力，一定程度上实现了辅酶偏好性转变。辅酶NAD(H)和NADP(H)相比而言，NAD(H)有稳定性好、价格低廉及更广的辅酶循环再生方法等优势，可以推进该酶的工业化应用。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用。

背景技术

二氨基庚二酸脱氢酶(diaminopimelate dehydrogenase)由基因ddh所编码。二氨基庚二酸脱氢酶催化氨、NADPH以及四氢吡啶二羧酸形成内消旋二氨基庚二酸的可逆反应，这是细菌赖氨酸生物合成途径中L-赖氨酸的直接前体。由于哺乳动物缺乏该代谢途径，该途径中酶的抑制剂可用作抗生素或除草剂。这种酶最早是在芽孢杆菌、球形杆菌、谷氨酸棒杆菌和短杆菌中发现。

二氨基庚二酸脱氢酶是一个二聚体，显示立体感meso-DAP异构体的特异性。它是结构不同的亚基的同型二聚体。每个亚基由三个域组成。N-末端结构域包含修饰的二核苷酸结合结构域，或者是Rossman折叠(213456拓扑结构中的六个中央β-链，被五个α-螺旋包围)。第二个结构域包含两个α-螺旋和三个β-链。该域被称为二聚化域，因为它参与形成二聚体的单体-单体界面。第三个结构域又称为C端结构域由六个β-链和五个α-螺旋组成。两个单体中N端和C端结构域的相对位置不同，定义了一个开放和一个封闭的构象，分别代表酶的结合和活性状态。

二氨基庚二酸脱氢酶与NADPH有很强的亲和性是因为其与辅酶NADPH的2’磷酸位置的相互作用。理论上来说，NADPH偏好性氧化还原酶与对应负电2’P作用，需要带正电残基的参与，通常为Arg和Lys(60％)，以及极性不带电Ser、Asn，能够与之形成氢键作用，稳定与NADPH结合。由于二氨基庚二酸脱氢酶利用的辅酶NADPH稳定性差，价格高，所以限制了此酶的应用。在实际生产应用上，多倾向于使用NAD(H)依赖型的脱氢酶。对DAPDH进行辅酶专一性改造，可以为DAPDH潜在的工业化应用提供支撑。到目前为止尚无谷氨酸棒状杆菌中二氨基庚二酸脱氢酶的辅酶偏好性改造的报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明首次将来自C.glutamicum XQ-5的二氨基庚二酸脱氢酶的36位Arg突变成Glu，并在E.coli BL21(DE3)中进行过表达。结果表明突变酶以NADH为辅酶的活力大于以NADPH为辅酶的活力，一定程度上实现了辅酶偏好性转变。

本发明的第一个目的是提供一种二氨基庚二酸脱氢酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的二氨基庚二酸脱氢酶的第36位精氨酸突变为谷氨酸获得。

本发明的第二个目的是提供一种所述的二氨基庚二酸脱氢酶突变体的编码基因。

进一步地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种携带所述编码基因的重组质粒。

进一步地，所述的重组质粒是以pET系列载体为表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述二氨基庚二酸脱氢酶突变体的基因工程菌。

进一步地，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。

本发明的第五个目的是提供所述的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)表达载体pET-28a-ddh的构建

将核酸序列如SEQ ID NO.1所示的ddh片段与经相同限制性内切酶酶切后的E.coli的表达质粒pET-28a相连构建重组质粒pET-28a-ddh；