[发明专利]一种热稳定性增强的H7N9禽流感病毒HA蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种热稳定性增强的H7N9禽流感病毒HA蛋白，其特征在于，所述热稳定性增强的H7N9禽流感病毒HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的热稳定性增强的H7N9禽流感病毒HA蛋白，其特征在于，编码所述热稳定性增强的H7N9禽流感病毒HA蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种禽流感亚单位疫苗，其特征在于，包括如权利要求1所述的热稳定性增强的H7N9禽流感病毒HA蛋白。

4.根据权利要求3所述的禽流感亚单位疫苗，其特征在于，还包含佐剂。

5.根据权利要求4所述的禽流感亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂为白油佐剂、SEPPIC MONTANIDE^TM GEL 02 PR、SEPPIC MONTANIDE^TM ISA 201 VG、SEPPICMONTANIDE^TMISA 71 VG或SEPPIC ESSAI ISA 78 VG。

6.一种如权利要求1-2任一所述的H7N9禽流感病毒HA蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)扩增热稳定性增强的H7N9禽流感病毒HA蛋白基因，然后经限制性内切酶消化后插入到pACEBac1转移质粒的PH启动子后面，构建重组转移质粒pACEBac1-HA_(T)；

(2)将重组转移质粒pACEBac1-HA_(T)转化DH10Bac大肠杆菌，通过转座重组，获得重组杆状病毒质粒Bacmid-HA_(T)；

(3)用脂质体法将重组杆状病毒质粒Bacmid-HA_(T)转染sf9昆虫细胞从而获得重组杆状病毒rBV-pA1-HA_(T)；

(4)将获得的重组杆状病毒rBV-pA1-HA_(T)继续感染sf9昆虫细胞或High-five昆虫细胞即可获得热稳定性增强的H7N9禽流感病毒HA蛋白。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中扩增热稳定性增强的H7N9禽流感病毒HA蛋白基因包括以下步骤：

以禽流感病毒株H7N9-rGD79的HA基因作为底物模板，采用重叠PCR进行碱基定点突变并扩增，重叠PCR所用的引物包括如SEQ ID NO:3所示和如SEQ ID NO:4所示的引物对，以及如SEQ ID NO:5所示和如SEQ ID NO:6所示的引物对。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中扩增热稳定性增强的H7N9禽流感病毒HA蛋白基因得到的PCR产物的N端融合Kozak序列，扩增热稳定性增强的H7N9禽流感病毒HA蛋白基因得到的PCR产物的C端融合6×His标签。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中扩增热稳定性增强的H7N9禽流感病毒HA蛋白基因得到的PCR产物的两端分别引入BamH I和EcoR I酶切位点。

10.热稳定性增强的H7N9禽流感病毒HA蛋白在制备禽流感疫苗中应用，其特征在于，所述热稳定性增强的H7N9禽流感病毒HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。