[发明专利]一种低温ɑ-淀粉酶的突变体及构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种低温ɑ‑淀粉酶的突变体及构建方法和应用，解决现有技术中低温α‑淀粉酶热稳定性较差，不利于酶的长期储存、开发和工业应用的技术问题。本发明对一种低温ɑ‑淀粉酶进行定点突变，获得两个单突变体G181P、G451P和一个双突变体G181P/G451P。突变体的热稳定性都明显提高，在40℃保温60min，突变体的残余活性分别提高为原来的1.7、2.0和2.7倍；突变体的催化效率也都得以提高。本发明提供了突变后的基因序列、包含上述基因的重组载体以及突变方法。本发明利用基因工程改造后的突变低温ɑ‑淀粉酶在食品加工、纺织品退浆、生物燃料制造等方面展现出较大的应用潜能，可广泛应用于基因工程领域。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体为一种低温ɑ-淀粉酶的突变体及构建方法和应用。

背景技术

α-淀粉酶是一种非常重要的水解酶，可以在淀粉类物质的内部切断ɑ-1,4-糖苷键，逐渐产生麦芽糖、糊精等一些小分子的产物，广泛存在于动植物和微生物中，在酿造、造纸、洗涤剂、医药以及纺织等行业都有重要应用，占全球酶市场的25～30％。但目前应用的主要为中高温的α-淀粉酶，不适宜用于要求低温处理的食品、饲料、纺织等工业，而且中高温酶在应用中通常需要通过加热升温来保证其催化活性，因此会消耗较多的能源及成本。随着全球范围内对节能及环保的日益重视，寻找在低温条件下能发挥功能的α-淀粉酶已成为科学家们研究的重点。

低温α-淀粉酶是近些年逐渐引起学者们重视并不断研究的一类酶类，它们能克服中高温α-淀粉酶的缺陷，在30℃以下能够表现出良好的催化活性，无需加热就可以高效地完成催化反应，减少在高温可能发生的不良化学反应，提高产品质量。因此，低温α-淀粉酶已成为一些工业理想的生物催化剂，在食品加工、低温洗涤、低温废水处理和寒冷气候条件下的生物修复等领域具有广阔的工业应用潜力。但低温α-淀粉酶通常热稳定性较差，不利于酶的长期储存、开发和工业应用。因此，如何保持低温α-淀粉酶的低温特性，同时提高其热稳定性是目前急需研究和解决的问题。目前国内外对低温α-淀粉酶的研究报道还比较少，商业化的低温α-淀粉酶就更少，因此为满足不断增长的工业需求，新型低温α-淀粉酶的不断挖掘、研究、改造和规模化生产就显得非常重要了。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的缺点和不足，提供了一种利用基因技术定点突变改造低温α-淀粉酶野生重组菌，显著提高其热稳定性、碱性环境下的pH稳定性、催化性能，可满足工业生产的更高要求、可使用范围广的低温ɑ-淀粉酶突变体及构建方法和应用。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：本发明提供的一种低温ɑ-淀粉酶的突变体，低温α-淀粉酶突变体分别为单突变体G181P、单突变体G451P、双突变体G181P/G451P其中任何一种；其对应的基因的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示的序列。

能表达生产上述低温ɑ-淀粉酶突变体的载体，含有低温α-淀粉酶突变基因的重组载体。

能表达生产上述低温ɑ-淀粉酶突变体的宿主细胞，含有所述低温α-淀粉酶突变基因的基因工程菌。

上述低温ɑ-淀粉酶突变体的构建方法，以基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生重组低温α-淀粉酶为出发序列，对其基因进行定点突变设计，获得单突变体G181P、单突变体G451P和一个双突变体G181P/G451P，构建包含所述低温ɑ-淀粉酶突变体的编码基因的重组载体，将重组载体转入宿主细胞中，经过筛选得到阳性转化子，培养得到重组表达菌株；诱导重组表达菌株的蛋白表达，得到低温ɑ-淀粉酶突变体蛋白。

优选的，定点突变设计具体步骤如下：

RMSF值反映的是蛋白氨基酸残基的柔韧性，不同温度下RMSF差值越大，氨基酸的柔性越大，稳定性越差；

比较313K和298K条件下野生重组酶各氨基酸残基的RMSF值，选择RMSF差值最大的Gly181和Gly451作为突变对象；