[发明专利]一种低温ɑ-淀粉酶的突变体及构建方法和应用

权利要求书

1.一种低温ɑ-淀粉酶的突变体，其特征在于，所述低温α-淀粉酶突变体分别为单突变体G181P、单突变体G451P、双突变体G181P/G451P其中任何一种；其对应的基因的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示的序列。

2.能表达生产权利要求1所述的低温ɑ-淀粉酶突变体的载体，其特征在于，含有所述低温α-淀粉酶突变基因的重组载体。

3.能表达生产权利要求1所述的低温ɑ-淀粉酶突变体的宿主细胞，其特征在于，含有所述低温α-淀粉酶突变基因的基因工程菌。

4.根据权利要求1所述的低温ɑ-淀粉酶突变体的构建方法，其特征在于，以基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的低温α-淀粉酶野生重组菌为出发序列，对其基因进行定点突变设计，获得单突变体G181P、单突变体G451P和一个双突变体G181P/G451P，构建包含所述低温ɑ-淀粉酶突变体的编码基因的重组载体，将所述重组载体转入宿主细胞中，经过筛选得到阳性转化子，培养得到重组表达菌株；诱导所述重组表达菌株的蛋白表达，得到低温ɑ-淀粉酶突变体蛋白。

5.根据权利要求4所述的低温ɑ-淀粉酶突变体的构建方法，其特征在于，所述定点突变设计具体步骤如下：

RMSF值反映的是蛋白氨基酸残基的柔韧性，不同温度下RMSF差值越大，氨基酸的柔性越大，稳定性越差；

比较313K和298K条件下野生重组酶各氨基酸残基的RMSF值，选择RMSF差值最大的Gly181和Gly451作为突变对象；

利用I-Mutant 2.0(https://folding.biofold.org/i-mutant/i-mutant2.0.html)在线服务器进行虚拟饱和突变预测，即将Gly181和Gly451突变为其它19种氨基酸，分析自由能改变情况，最终确定将Gly181和Gly451突变为刚性的Pro，分别设计低温ɑ-淀粉酶突变体：单突变体G181P、G451P和双突变体G181P/G451P。

6.根据权利要求4或者5所述的低温ɑ-淀粉酶突变体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)突变全长基因的获得：定点突变、采用两步法PCR扩增，分别设计首尾引物(Mut-F、Mut-R)和突变引物，先利用首尾引物和突变引物相应组合进行第一次PCR扩增出带有突变位点且相互间具有重叠的的2个或3个DNA片段，再利用首尾引物进行融合第二步PCR扩增后，获得突变基因全长，即所述低温ɑ-淀粉酶突变体基因；

2)突变基因重组表达载体的构建：利用DNA回收试剂盒对步骤1)中获得的第二步PCR扩增后的产物进行纯化，将纯化产物低温ɑ-淀粉酶突变体基因和空表达载体pET-28a(+)分别用限制性内切酶BamH I与Xho I双酶切、在37℃条件下水浴酶切3h，然后对酶切后的产物分别进行纯化，得到酶切并纯化后的目的基因；

将上述酶切并纯化后的目的基因与表达载体pET-28a(+)于16℃条件下进行酶连接，之后将连接产物直接转入大肠杆菌DH5ɑ克隆感受态细胞中，得到携带低温ɑ-淀粉酶突变体基因的重组载体，提取重组载体再转化受体菌株BL21，得到携带低温ɑ-淀粉酶突变体基因质粒的重组工程菌株；

采用酶切方法进行验证，筛选鉴定出阳性重组子；然后将阳性菌落挑至加有Kana(终浓度为100μg/mL)的LB液体培养基中进行振荡培养，以甘油菌形式进行保存，同时进行测序验证，得到携带低温ɑ-淀粉酶突变体基因质粒的重组工程菌株。