[发明专利]一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法及其应用

权利要求书

1.一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，制备步骤如下：

(1)建立PN/PDRN的DNA文库

(2)自步骤(1)DNA文库中选取固定长度重组PN/PDRN；

(3)将步骤(2)固定长度重组PN/PDRN作连结，得到多拷贝重组PN/PDRN；

(4)将步骤(3)多拷贝重组PN/PDRN连结到克隆载体，得到多拷贝重组PN/PDRN克隆载体；

(5)将步骤(4)多拷贝重组PN/PDRN克隆载体引入适合细菌宿主，得到转化子；

(6)将步骤(5)转化子进行培养，取得大量转化子；将转化子裂解并提取出多拷贝重组PN/PDRN克隆载体；

(7)将步骤(6)多拷贝重组PN/PDRN克隆载体进行酶切和分离，以提取出固定长度的重组PN/PDRN。

2.根据权利要求1所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述PN/PDRN，可以提取自包括但不限于人类细胞/组织、大西洋鲑鱼精细胞/精囊组织、虹鳟鱼精细胞/精囊组织、太平洋鲑鱼精细胞/精囊组织、中华鲟精细胞/精囊组织，长度介于30～5000个碱基对，更优选为50～2000个碱基对；PN/PDRN的DNA文库建立方式，可以使用包括但不限于自行设计制备、赛默飞MuSeek文库制备套组、赛默飞ClaSeek文库制备套组、赛默飞Invitrogen Collibri PCR-Free PS文库制备套组或赛默飞Invitrogen Collibri PSDNA文库制备套组，更优选为自行设计制备。

3.根据权利要求1所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述固定长度PN/PDRN，固定长度是指介于30～5000个碱基对，更优选为50～2000碱基对；固定长度重组PN/PDRN可自步骤(1)DNA文库进行选殖或聚合酶链式反应扩增、或人工合成取得；PN/PDRN的序列不定，更优选为非编码区域的序列。

4.根据权利要求1所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，步骤(3)中将固定长度重组PN/PDRN连结，可以使用包括但不限于T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T7 DNA连接酶进行连结，优选为T4 DNA连接酶；步骤(3)中所述多拷贝重组PN/PDRN，包含2或多个拷贝固定长度的PN/PDRN片段。

5.根据权利要求1所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，步骤(4)中将多拷贝PN/PDRN连结到克隆载体，可以选用包括但不限于T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T7 DNA连接酶进行连结，优选为T4 DNA连接酶；步骤(4)中所述克隆载体，包含但不限于pUC系列载体、pGEM系列载体、pBluescript系列载体、pTZ系列载体中的一种或多种，载体拷贝数100，首选为拷贝数300的载体。

6.根据权利要求1所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述适合细菌宿主，包含但不限于大肠杆菌株MC1061、DH5α、DH10B、BL21、Top10、DB3.1中的一种或多种，首选为DH10B、BL21。

7.根据权利要求1所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述培养，包含但不限于GYT培养基、Luria-Bertani培养基、M9培养基、NZCYM培养基、NZYM培养基、NZM培养基、SOB培养基、SOC培养基、Terrific肉汤培养基、2×YT培养基中的一种或多种，首选为Luria-Bertani培养基、Terrific肉汤培养基，培养温度35±2℃，培养时间12～30小时。依克隆载体上的筛选标签类型，培养基需外加适当抗生素进行筛选；步骤(6)中所述裂解并提取出重组PN/PDRN克隆载体，裂解方法包含但不限于碱溶解法、煮沸法、酵素法或机械破碎法，首选为碱溶解法或机械破碎法；提取方法包含但不限于沉淀法、超高速离心法、膜过滤法、层析法的一种或多种，首选为沉淀法。