[发明专利]一种通用引物及其在多细胞种属鉴别和交叉污染检测中的应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体提供了一种能够同时扩增出多种哺乳类和昆虫类COI基因的通用引物，以及利用该通用引物进行细胞种属鉴定和交叉污染检测的方法。本发明提供的这种方法覆盖度广，能够对所有哺乳类和昆虫类细胞进行种属鉴别及种属间交叉污染检测；只需对各细胞COI基因扩增后进行酶切检测，且15分钟酶切后片段与理论完全相符，具有操作简单、精确和效率高等优势；样品使用量少，在酶切前对各物种标志性COI基因进行PCR扩增时，只需100ng DNA就能实现其种属鉴别和所有哺乳类及昆虫类种属间交叉污染检测，节省样品用量且灵敏度高；对酶切后片段进行琼脂糖凝胶电泳分析，操作简单、耗时短、效率高。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种通用引物及其在多细胞种属鉴别和交叉污染检测中的应用。

背景技术

生物制品产业是制药产业的重要组成部分，近年来得到了飞速的发展。因为哺乳动物细胞体外培养技术的日益成熟及其表达产物的生物学特性更接近人体的天然产物，据统计，大约70％的治疗性重组蛋白药物是由哺乳动物细胞表达生产。近年来，随着昆虫杆状病毒表达体系(baculovirus expression vector system，BEVS)的不断完善，BEVS凭借其研发速度快、产量高及风险低等优势，越来越多的被用来生物制品的生产。目前，已经有7种产品获批，4种为人用，包括疫苗及治疗产品。草地贪叶蛾卵巢细胞系和粉纹夜蛾胚胎细胞是杆状病毒的受体细胞，也是目前研究和应用最多的两种细胞系。

不同类型的细胞在制备，扩培及改造等体外操作的过程中，很容易发生细胞间交叉污染，细胞间交叉污染不但会对实验结果的准确性和重复性产生影响，同时也会影响生物制品产量和质量，甚至造成生物制品表达的失败。2020新版药典生物制品生产检定用动物细胞质基质制备及质量控制中明确规定新建细胞系/株、主细胞库(MCB)、工作细胞库(WCB)和生产终末细胞(EOPC)需进行鉴别试验，以确认为本细胞且无其他细胞交叉污染。目前，常用于细胞鉴别及细胞交叉污染的方法有STR图谱分析法、细胞核型分析和同工酶技术等。其中，STR图谱分析法只适用于少数物种细胞鉴别及种内间细胞交叉污染；染色体核型分析和同工酶技术操作复杂、耗时且检测效率低。因此急需建立一种稳定高效的细胞鉴别及细胞种属间交叉污染的检测方法。

线粒体基因是一种相对独立的遗传分子单元，具有母系遗传的特点，其序列突变率低，相对较核基因而言保守，是物种分类，种群遗传学及进化生物学等方面的重要的分子依据，其中，使用较多的有16s rRNA基因、COI基因和Cy b基因等。CAPS标记技术是一项发展较为成熟的分子生物学技术，又称为PCR-RFP技术，其根据相应的基因设计对应的引物，并对其目的序列进行扩增，根据PCR扩增产物的酶切片段的多态性的不同，从而实现基因分型、基因定位、品种鉴定等目的。本发明设计了一套能够同时扩增出哺乳类和昆虫类COI基因的通用引物，并在生物制品常用的9种哺乳类细胞和2种昆虫类细胞上进行了验证，同时本法通过对哺乳类和昆虫类COI基因酶切位点进行了预测，随后，使用上述的细胞系对多种内切酶进行验证，从中筛选出一对特异性好，稳定性强的核酸内切酶BseGI和MvaI，建立了一套稳定的双酶切体系。本法操作简单，快速，稳定性强是一项较为完善的多细胞种属鉴别及种属间交叉污染的技术。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中细胞用量大、操作复杂、检测效率低及成本高的问题。

为此，本发明提供了基于CAPS标记的通用引物，所述通用引物序列为MI-COI-F：TYATAGTAATACCCATWATAATTGGRGG；MI-COI-R：CCTCCTATAATAGCAAAWACWGCTCC。

具体的，上述通用引物能够同时扩增出哺乳类和昆虫类COI基因。

具体的，上述通用引物能同时扩增出CHO-K1、BHK-21、Vero、Hela、BALB/c-3T3、Walker-256、PG-4、MDBK、MDCK、sf9和Hi-5细胞。

本发明还提供了一种细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法，包括以下步骤：