[发明专利]一种通用引物及其在多细胞种属鉴别和交叉污染检测中的应用有效
| 申请号： | 202111018171.3 | 申请日： | 2021-09-01 |
| 公开（公告）号： | CN113604585B | 公开（公告）日： | 2022-06-21 |
| 发明（设计）人： | 臧照星;幸晓莹;徐国东;刘愈杰 | 申请（专利权）人： | 武汉珈创生物技术股份有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6888 | 分类号： | C12Q1/6888;C12Q1/6858;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京汇泽知识产权代理有限公司 11228 | 代理人： | 吴静 |
| 地址： | 430000 湖北省武汉市东湖新技术开发区高新二路3*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 通用 引物 及其 细胞 种属 鉴别 交叉 污染 检测 中的 应用 | ||
1.一种细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备待测细胞样品；
(2)提取待测细胞样品的基因组DNA；
(3)以待测细胞样品的基因组DNA为模板，利用通用引物进行PCR扩增，所述通用引物序列为MI-COI-F：TYATAGTAATACCCATWATAATTGGRGG；MI-COI-R：CCTCCTATAATAGCAAAWACWGCTCC；
(4)PCR反应结束后，对PCR扩增产物进双酶切反应，双酶切反应使用的内切酶为BseGI和MvaI；
(5)对双酶切反应产物进行电泳检测，根据酶切位点多态性鉴定细胞样品种属并判断是否发生交叉污染；
所述方法能用于CHO-K1、BHK-21、Vero、Hela、BALB/c-3T3、Walker-256、PG-4、MDBK、MDCK、sf9和Hi-5细胞的种属鉴别和交叉污染检测。
2.如权利要求1所述的细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR扩增的反应体系为：10xBuffer for KOD-Plus-Neo 2.5μl，10μM MI-COI-F 0.5μl，10μM MI-COI-R 0.5μl，2mM dNTPs 2.5μl，25mM MgSO4 2μl，100ng/μl的模板DNA 1μl，PCR级别水15.5μl，1.0U/μl KOD-Plus-Neo 0.5μl。
3.如权利要求1所述的细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s，45℃退火15s，68℃延伸15s，进行5个循环；98℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸15s，进行30个循环；72℃完全延伸5min；16℃保存。
4.如权利要求1所述的细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法，其特征在于：所述步骤(4)中进行双酶切反应前还包括对PCR扩增产物进行纯化。
5.如权利要求1所述的细胞种属鉴别和交叉污染检测的方法，其特征在于，所述步骤(4)中双酶切反应体系为：10Xbuffer 1.5μl，1％BSA 0.5μl，enzyme 1 0.5μl，enzyme 2 0.5μl，30ng/ul的PCR纯化产物8μl，无菌水4μl。
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