[发明专利]一种无支架牙周膜干细胞球及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种无支架牙周膜干细胞球及其制备方法与应用。本发明利用细胞球培养板三维培养技术，制备无支架牙周膜干细胞球并将无支架牙周膜干细胞球应用到成骨分化相关的组织工程。本发明的无支架牙周膜干细胞球具有良好的稳定性和生物活性，及较强的成骨分化效能，可用作牙周组织工程、骨组织工程领域中的细胞骨替代材料或与支架材料结合运用，提高成骨效能。通过该发明培养收集所得的无支架牙周膜干细胞球大小均匀一致，能够维持较长时间的细胞活性；与此同时，本发明制备方法可重复，简便易行，不需要依赖大型设备或装置，有利于快速有效获得细胞球结构。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种无支架牙周膜干细胞球及其制备方法与应用。

背景技术

目前，传统的细胞培养以培养瓶或培养皿为代表的二维培养模式为主。该培养模式并不具备活体组织的空间形态，在培养过程中，细胞往往出现某一特定组织性质丢失的情况。在真实的人体环境中，相邻细胞之间以及胞外基质间相互渗透沟通，形成立体的空间组织，构成复杂的生物化学信号网络，这一结构对细胞的正常生理活动意义重大。多数情况下，二维细胞培养方法体外研究所得结果与体内实验不相符合，一方面与细胞在体外环境下随着传代次数的增多逐渐丧失其原有性状有关，另一方面也与体内实验受到多种因素和复杂环境影响所致。为了尽可能真实地模拟细胞所处的体内微环境，越来越多的研究开始关注细胞三维培养。

研究发现，细胞球成球机理主要与细胞的黏附和分化有关，在细胞球的形成过程中整合素、钙粘蛋白、胞外纤维等被发现或表达上调。制作细胞球的方法主要有悬滴培养(hanging drop)、利用旋转生物反应器(rotating bioreactor)培养、无黏附表面的塑料制品培养、利用外部力量制作、改变培养基成分、微基板等方法。上述方法往往存在批量生产较困难、所获得细胞球尺寸、数目及形态有差异、培养细胞类型有限，需专门设备成本高等问题。相对而言，细胞培养板法操作简便，可批量生产，逐渐应用于三维细胞培养领域。该方法以琼脂糖凝胶等为载体，利用预置尺寸的模具在6孔板、24孔板或96孔板中制作不同尺寸孔板，通过接种不同种类和数量的的细胞来制备细胞球。

牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)来源于新鲜牙周膜组织，具有很高的增殖和克隆形成能力，高表达间充质干细胞标记物STRO-1和CD146/MCU18，具备多向分化潜能，是较为理想的牙周组织再生的种子细胞来源。研究表明相较于二维培养细胞，三维培养所得的PDLSC细胞球成骨分化能力有所提高。应用三维动态微重力装置培养PDLSCs发现，经过成骨诱导后细胞基质矿化结节有所增加，相关基因表达上调。将hPDLSCs包裹于海藻酸钠微球中，应用生物反应器模拟体内环境观察动态液流对PDLSCs生物活性的影响。经过14天成骨诱导后，细胞表现出更为显著的矿化能力，结果显示生物反应器培养有利于细胞成骨分化和矿化基质的形成。将PDLSCs接种于葡聚糖微载体，比较旋转微重力培养环境与普通重力环境对细胞生长状态的影响，发现在微重力环境下微载体表面细胞多呈半球形，细胞生长速度明显加快。与普通培养方式相比，PDLSC细胞球呈现出一定的成骨趋势。采用悬滴培养法形成牙周膜成纤维细胞球，将其与胶原/聚乙二醇膜复合，发现细胞球能黏附于膜上，免疫组化染色结果显示细胞表达Col-I、periostin和Runx2。上述所制备的无支架牙周膜干细胞球在制备和使用过程中大多需要依赖支架材料。然而，多数支架材料的降解速度与细胞的生长分化不一定能相互协调。部分支架材料的降解产物为酸性，可能导致局部炎症的发生。支架材料在原料及配比选择、层次结构及降解性能等方面尚有待改善，才能更真实模拟细胞外基质环境。

发明内容