[发明专利]一种基于2-氨基嘌呤和酶切放大技术检测铅离子的方法

说明书

本发明公开了一种以2‑氨基嘌呤(2‑aminopurine，2‑AP)作为荧光信号探针，结合Pb²⁺的特异性核酸适配体以及核酸外切酶I(Exo I)的检测方法用于灵敏地检测Pb²⁺。延长Pb²⁺特异性适配体的3’端序列，使其形成自身互补的平末端发夹结构，延长的序列中使用2‑AP替换了其中一个腺嘌呤。Exo I几乎不能水解发夹结构的核酸，2‑AP嵌在双链中，体系荧光很低。当体系中存在Pb²⁺时，Pb²⁺诱导该核酸形成3’端携9个碱基序列的G‑四链体结构，2‑AP此时处于单链中，体系荧光上升。Exo I能够水解该结构，2‑AP游离出来，体系荧光进一步增强。Pb²⁺浓度在5‑60nM范围内与荧光回升强度(F₂‑F₁)之间存在线性相关，检出限为0.049nM。本发明灵敏度高、选择性好，实现了对实际样品中Pb²⁺的快速检测。

技术领域

本发明涉及一种铅离子高效灵敏的检测方法，具体涉及一种基于2-氨基嘌呤和酶切放大技术检测铅离子的方法。

背景技术

铅(Pb)是环境中含量最高、毒性最强的金属之一，主要通过工业使用和家用物品(如铅基颜料和电池)释放到空气、土壤和水中。由于铅能够在生物体内积累，长期接触低水平的Pb也可能导致中毒。铅是一种全身毒性物质，影响肾脏、胃肠道、心血管、生殖和神经系统，从而导致多种疾病，其中神经系统是最脆弱的靶器官。研究发现，儿童更容易被铅的毒性影响身体健康，导致一系列问题。传统的铅离子检测方法依赖于实验室成熟且高灵敏度的分析技术，如原子吸收光谱法(AAS)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、原子发射光谱法(AES)和X-射线荧光光谱法(XRF)等。这些技术可以准确测定铅离子浓度，但大多数都存在一定的局限性，如仪器庞大昂贵、设备运行成本高、需要专业的科研人员等，主要适用于实验室分析，很难应用于现场快速检测。因此开发简便快速的现场检测铅离子的方法是很有必要的。

核酸适配体(aptamer)是1990年首次发现的短单链RNA或DNA序列(20-60个核苷酸长度)，具有高灵敏度、高结合亲和力、高稳定性和良好的选择性。到目前为止，适配体被开发用于检测多种目标物，如小分子、离子、蛋白质和细胞等。Pb²⁺可以诱导设计的富含G的DNA序列转化为稳定的G-四链体构型，具有约10^-6mol的高亲和常数。

2-氨基嘌呤(2-aminopurine，2-AP)是腺嘌呤的类似物，可以取代腺嘌呤而不破坏DNA的结构，并与胸腺嘧啶形成稳定的配对。游离的2-AP具有较强的荧光信号，2-AP嵌入单链DNA时，由于碱基堆积相互作用，其荧光被猝灭，而嵌有2-AP的单链DNA与其互补链结合形成双螺旋结构时，荧光被进一步猝灭。基于2-AP构建的检测方法避免了标记额外的猝灭剂。此外，考虑到2-AP嵌入在DNA序列中，因此受到相邻碱基的保护，有望具有更强的抗干扰能力。

近年来，为了提高检测方法的灵敏度，研究人员开发了许多生物和化学信号放大策略，常见的包括杂交链式反应(hybridization chain reaction，HCR)、滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)、核酸工具酶辅助反应和基于纳米材料的反应等。与其他信号放大策略相比，核酸工具酶辅助信号放大策略具有许多突出的优点：(1)核酸工具酶对底物具有高效的催化作用，因此可以保证灵敏度；(2)所涉及的酶的反应条件温和；(3)部分核酸工具酶具有序列特异性或底物偏好性，利于设计新的检测方法；(4)来源于活细胞的核酸工具酶在生化分析中表现出更好的生物相容性。核酸外切酶I(Exo I)是一种与序列无关的酶，能够从3’端到5’端降解单链DNA，裂解核苷酸之间的磷酸二酯键，但不能催化双链DNA的水解。

本发明利用核酸适配体作为识别探针，2-氨基嘌呤作为荧光探针，结合酶切信号放大技术，构建了一种检测方法，实现了对铅离子的高效灵敏检测。

发明内容