[发明专利]呕吐毒素特异性核酸适配体及应用

说明书

本发明提供呕吐毒素特异性核酸适配体及应用。本发明以呕吐毒素(DON)为靶标，利用竞争SELEX技术经过7轮反复的孵育、清洗、解离、扩增、λ‑核酸外切酶消化，从一个单链DNA随机文库中筛选出可与DON特异性结合的核酸适配体。克隆测序并合成2条代表性序列后，通过SPR和PCR方法对其进行亲和力测定，获得可与呕吐毒素(DON)特异性结合的核酸适配体DO8，序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的核酸适配体具有高特异性，能高亲和地结合DON，可用于农产品中污染DON的快速检测。

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，具体地说，涉及呕吐毒素特异性核酸适配体及应用。

背景技术

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)，又名呕吐毒素，是最常见的真菌毒素之一，具有较高的污染率，广泛存在于小麦、大麦、玉米、燕麦等粮食作物中。DON具有广泛的毒性作用，对细胞周期和细胞凋亡、机体生化反应、消化和免疫系统等均有毒害效应，还有一定的胚胎毒性和致畸性。世界各国及组织都对食品中DON的含量做了限定，我国国家标准GB 2761-2017中规定玉米、玉米面(渣、片)、大麦、小麦、麦片、小麦粉中DON的限量为1000μg/kg。

目前，DON的检测方法主要有薄层色谱法、液相色谱法及色谱质谱联用技术、酶联免疫法和胶体金免疫层析法等，这些方法检测限低、精密度高，但是操作复杂、检测成本高。因此亟需建立一种快速、简单、低成本的DON检测方法。

核酸适配体是通过指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution ofligands by exponential enrichment,SELEX)从随机核酸文库中筛选得到的一段具有高亲和力与特异性识别作用的单链DNA/RNA寡核苷酸(10-100nt)片段。适配体可以自身折叠成复杂的二级或三级结构，如茎、环、凸、假结体、四角环、发卡结构和G-四链体等，实现与特定靶标的高特异性和高亲和力地识别，从而结合形成靶标-适配体的稳定复合物。适配体与抗体相比具有明显的优势，适配体不仅具有尺寸小、生产成本低、稳定性高、无免疫原性、容易化学合成、适于开发多样化的检测方法等优点，而且更容易用荧光染料、酶和生物素等标记。

发明内容

本发明的目的是提供一组呕吐毒素特异性核酸适配体及应用。。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供呕吐毒素特异性核酸适配体，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO:1所示，命名为DO8。

本发明的DON核酸适配体是基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术获得的，其以DON为靶标，筛选可与靶标特异结合的核酸适配体，以达到快速、准确诊断粮食作物中DON的目的。

所述核酸适配体的5'端或3'端可进行生物素、荧光素、氨基、巯基、纳米发光材料或地高辛化学修饰。

第二方面，本发明提供所述核酸适配体在呕吐毒素的分离、富集和检测中的应用(含非诊断和治疗目的)。

第三方面，本发明提供所述核酸适配体在制备呕吐毒素检测试剂或试剂盒中的应用。

第四方面，本发明提供呕吐毒素核酸适配体试纸条，包括样品吸收垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，所述样品吸收垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴在底板上。

所述样品吸收垫包被有检测探针，所述检测探针为荧光素标记的呕吐毒素适配体，适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有DON-载体蛋白偶联物，所述载体蛋白可以是牛血清白蛋白、卵清蛋白(OVA)、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白。

所述检测线包被有序列CS1：5’-AGTCGGGCAGACTCCGTGCC-3’(适配体的互补序列，SEQ ID NO:3)。