[发明专利]一种维生素25（OH）D3异构体的检测方法

说明书

本发明公开了一种维生素25(OH)D3异构体的检测方法，属于维生素检测方法技术领域，将标准品稀释为20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL和0.625ng/mL6个浓度，C3异构体同位素内标稀释为100ng/mL溶液备用，将准确定量测定C3‑epi水平，提高维生素D测定的准确度。

技术领域

本发明涉及一种维生素检测方法，特别是涉及一种维生素25 (OH)D3异构体的分离与检测方法，属于维生素检测方法技术领域。

背景技术

维生素D是类固醇衍生物，主要生理作用是调节钙的代谢，从而维持骨骼健康。

维生素D也可通过噬菌作用而增强免疫力，在抗肿瘤活性和免疫功能调节方面发挥着重要作用。

最新的研究指出，除骨质疏松、龋齿、儿童佝偻病等“经典”维生素D缺乏病外，多种慢性病的发生均与维生素D缺乏有关。

人体中的维生素D在肝脏内被25-羟基氧化酶氧化成25-羟基维生素D(25OHD)，25OHD是维生素D在人体内的主要循环形式。

部分25OHD经由肾脏再进一步的羟基化作用，转变为 1,25-(OH)2D。1,25-(OH)2D是维生素D的活性形式，维生素D的主要生理功能通过该形式实现，但是其在人体内的半衰期较短(3-4 小时)，且浓度受多种因素影响，其浓度不能准确反映人体维生素D 的营养水平。

25OHD是维生素D在体内的稳定存在形式，半衰期较长(约2 周)，因此其含量能客观的反映人体内维生素D的水平，可对25OHD 的浓度进行检测来评价人体的维生素D营养水平。

25OHD主要包括25OHD2(麦角钙化醇)和25OHD3(胆钙化醇)。两者获取途径不同。维生素D2不能由人体自身合成，只能从外界摄取，多含于植物性食物中，由植物的麦角固醇经阳光照射合成。

25OHD3可由人体皮肤和脂肪组织在7-脱氢胆固醇经阳光照射后合成，亦可通过从食物中摄取，主要存在于奶类、乳制品类、深海鱼类以及动物肝脏中。

越来越多的证据表明，25OHD2与25OHD3对骨骼健康同样有效。因此，临床和实验室专家建议应同时检测25OHD2和25OHD3，从而确保维生素D状态得到全面评价。

最近发现维生素D代谢物可以通过C3差向异构化途径进一步代谢。

25OHD3在肝脏中经历差向异构化过程，产生3-epi-25-羟基维生素D3[3-epi-25OHD3，C3-epi]，该异构体存在于99％样本中(从新生儿到80岁以上受试者)。

C3-epi是25OHD3的一种立体异构体，与25OHD3仅在C3位置不同，其中羟基位于α方向而不是β方向。

C3-epi的生理作用尚不清楚，但有体外数据表明，这种异构体对甲状旁腺激素的抑制作用与25OHD3相当。

因此，探讨C3-epi含量与人生理病理功能之间的关系越发重要，但是，由于C3差向异构体的质量和裂解模式与25(OH)D3的质量和裂解模式相同，因此当两种代谢物未经色谱分解时，会导致无法定量计算C3-epi含量以及高估25OHD3水平，这些发现对将25OHD3与其异构体分开进行特异性检测提出了挑战。

目前维生素D在临床实验室检测中常用的检测方法为免疫学法 (包括放射免疫学法、酶联免疫学法和化学发光免疫法等)和近年来新兴的串联质谱法。

前者只能检测总25OHD(即25OHD2与25OHD3之和)，无法分开检测25OHD2和25OHD3，更无法定量检测C3-epi，且VitD结合蛋白释放效率(疏水性)、代谢物中间产物的交叉反应、异嗜性抗体的干扰或缺乏国际标准等因素导致各种免疫分析方法间的变异太大，测定结果不准确。