[发明专利]一种维生素25（OH）D3异构体的检测方法

权利要求书

1.一种维生素25(OH)D3异构体的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤1：将标准品稀释为20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL和0.625ng/mL6个浓度，C3异构体同位素内标稀释为100ng/mL溶液备用；

步骤2：准确吸取200μL标准品溶液于2mL离心管中，分别加入10μL内标溶液，涡旋混匀后瞬时离心；

步骤3：再加入1mL释放剂，涡旋5分钟；高速离心5分钟后吸取800μL上清液至2mL离心管中；

步骤4：用氮吹仪吹干；再加入125μL复溶液(65％甲醇水溶液)，涡旋5分钟；高速离心5分钟后取上清液100μL供色谱分析进样分析；

步骤5：准确吸取200μL血清/血浆样本于2mL离心管中，分别加入10μL内标溶液，涡旋混匀后瞬时离心；

步骤6：再加入1mL释放剂，涡旋5分钟；高速离心5分钟后吸取800μL上清液至2mL离心管中；

步骤7：用氮吹仪吹干；再加入125μL复溶液，涡旋5分钟；高速离心5分钟后取上清液100μL供色谱分析进样分析；

步骤8：将处理好的标准品和血清/血浆样品各100μL注入96孔进样板中，覆上铝箔封膜，启用应用软件，建立样品列表，放入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，并记录质谱图与检测样品中C3异构体峰面积与相应内标峰面积；

步骤9：打开MultiQuantTM或Quantification软件，点击工具栏中的Creates a newResults Table，选择相应数据进行结果分析。以标准品浓度为横坐标，以标准品峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，制作标准曲线，将样品与内标的峰面积比代入方程，计算血清样本中维生素含量。

2.根据权利要求1所述的一种维生素25(OH)D3异构体的检测方法，其特征在于：其中步骤2中10μL内标溶液为100ng/mL C3异构体同位素内标。

3.根据权利要求2所述的一种维生素25(OH)D3异构体的检测方法，其特征在于：其中步骤3中1mL释放剂为叔丁基甲基醚，步骤3中所述高速离心转速为13000转/分钟。

4.根据权利要求3所述的一种维生素25(OH)D3异构体的检测方法，其特征在于：步骤4中125μL复溶液为65％甲醇水溶液，步骤4中所述高速离心转速13000转/分钟。

5.根据权利要求4所述的一种维生素25(OH)D3异构体的检测方法，其特征在于：其中步骤9中将标准品作为样品，对每个样品(x_i)均重复2次，分别计算测定结果的均值(y_i)。以样品浓度(x_i)为自变量，以测定结果均值(y_i)为因变量，采用统计软件求出线性回归方程，并计算线性回归方程的相关系数r，结果应符合a)的要求。将样品浓度(x_i)代入线性回归方程，计算y_i的估计值及y_i与估计值的相对偏差或估计值的绝对偏差，应符合b)的要求。

6.根据权利要求5所述的一种维生素25(OH)D3异构体的检测方法，其特征在于：步骤中采用的实验设备为JasperTM高效液相色谱仪，AB SCIEX Triple QuadTM4500MD质谱仪，高速离心机，涡旋混匀器，氮吹仪。