[发明专利]一种肾癌索拉非尼耐药细胞株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种肾癌索拉非尼耐药细胞株及其构建方法和应用，该构建方法包括将对数生长期的786‑O细胞接种在培养瓶中并进行培养；待细胞融合至50％～60％时，向培养基中添加索拉非尼并进行传代培养，得到第三代细胞；再将第三代细胞依次置于索拉非尼浓度梯度递增的培养基中分别进行传代培养；待培养基中索拉非尼浓度不低于10μM/L时，传代培养50～70天，分离786‑O细胞，即得所述肾癌索拉非尼耐药细胞株；该构建方法利用不同浓度的索拉非尼处理人肾癌细胞株786‑O细胞，逐步增加药物浓度法建立肾癌索拉非尼耐药细胞系,并以此浓度作为筛选浓度继续长期刺激细胞一段时间,最终获得肾癌索拉非尼耐药细胞株，索拉非尼耐受浓度达到10uM/L以上。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种肾癌索拉非尼耐药细胞株及其构建方法和应用。

背景技术

肾细胞癌(RCC)，在泌尿系统恶性肿瘤的发病率中排名第三。90％的成人肾脏恶性肿瘤起源于肾小管上皮细胞的恶性转化，但仍有30％的患者已处于肾癌晚期并发生转移，其5年生存率仅为10％。首诊时并无发生远处转移的患者中，约50％出现远处转移。在根治性手术治疗的局限性肾细胞癌患者随访中，20％患者出现肿瘤复发与恶化。全身治疗是晚期转移性肾癌的主要治疗方法，肾癌细胞对放疗和化疗敏感性不佳，而免疫治疗(IL-2)和干扰素治疗(IFN-α)不能有效延长患者生存周期，并伴有不同程度副反应。因此，靶向药物治疗是晚期转移性肾癌的首选治疗方法。

随着对肾细胞癌发病机制的深入研究，多种激酶抑制剂的开发为临床治疗提供了新途径，索拉非尼(Sorafenib,SORA)是第一个用于治疗转移性肾癌的口服分子靶向药物，通过抑制细胞内丝/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶(B-Raf和VBGFR/PDGFR等)的活性，抑制肿瘤细胞生长和血管生成，是肾癌治疗中常用的小分子靶向药物。尽管在临床研究中，索拉非尼已被证明可以改善患者的预后，但使用索拉非尼治疗晚期肾癌患者敏感性差异很大，仍有22％的患者出现耐药性，目前尚无索拉非尼反应的治疗性生物标志物，且在对索拉非尼耐药机制的研究中，尚无耐药细胞株，而肾癌索拉非尼耐药细胞系、构建方法及其应用暂无相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肾癌索拉非尼耐药细胞株及其构建方法和应用，该构建方法能够成功构建得到肾癌索拉非尼耐药细胞株，索拉非尼耐受浓度达到10uM/L。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明第一方面提供一种肾癌索拉非尼耐药细胞株的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

(a)将对数生长期的786-O细胞接种在培养瓶中并进行培养；

(b)待细胞融合至50％～60％时，向培养基中添加索拉非尼并进行传代培养，得到第三代细胞；再将第三代细胞依次置于索拉非尼浓度梯度递增的培养基中分别进行传代培养，其中，索拉非尼浓度梯度为1.8～2.2μM/L，每个培养基均传代培养至第三代细胞；

(c)待培养基中索拉非尼浓度不低于10μM/L时，传代培养50～70天，分离786-O细胞，即得所述肾癌索拉非尼耐药细胞株。

优选地，所述步骤(b)中，向培养基中添加索拉非尼至终浓度为2～4μM/L。

优选地，所述步骤(b)中，索拉非尼浓度梯度递增的培养基中最低索拉非尼浓度为4～6μM/L。

优选地，所述步骤(a)中，培养采用的培养基为含10％胎牛血清的DMEM-f12培养液。

优选地，所述步骤(a)中，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。

本发明第二方面提供一种上述构建方法构建得到的肾癌索拉非尼耐药细胞株。

优选地，所述肾癌索拉非尼耐药细胞株的索拉非尼耐受浓度10uM/L。