[发明专利]一种提高L-谷氨酸生产效率的谷氨酸棒杆菌的构建及应用

说明书

本发明公开了一种提高L‑谷氨酸生产效率的谷氨酸棒杆菌的构建及应用，属于基因工程和发酵工程领域。本发明在谷氨酸棒杆菌中敲除谷氨酸棒杆菌基因组上分枝菌酸酮酰基还原酶基因cmrA，使获得的C.glutamicum△cmrA在发酵培养基中L‑谷氨酸产量为13.14g/L，是出发菌株C.glutamicum ATCC 13869产量的10.77倍。本发明的方法提供了一种提高谷氨酸棒杆菌中氨基酸产量的新策略，在氨基酸的工业生产中有巨大的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种提高L-谷氨酸生产效率的谷氨酸棒杆菌的构建及应用，属于基因工程和发酵工程领域。

背景技术

L-谷氨酸是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一，可用于治疗肝性昏迷。另外，L-谷氨酸广泛应用于味精、香料、动物饲料和保健品的生产。

谷氨酸棒杆菌是重要的工业微生物，在L-谷氨酸生产方面具有天然优势。它的细胞壁由共价连接的肽聚糖(PG)，阿拉伯半乳聚糖(AG)，分枝菌酸(MA)以及糖脂组成的外层松散结构组成。位于外层的分枝菌酸层破坏后会显著改变细胞的通透性，有利于氨基酸和其它高附加值的生物合成产物的外排。

用于破坏分枝菌酸层诱导L-谷氨酸外排的传统方式是生物素限制，添加表面活性剂吐温40或者亚致死量的抗生素青霉素等，这些方法耗费大量的人力物力且有操作复杂容易引入污染等缺陷。因此，通过代谢工程改造获得谷氨酸棒杆菌分枝菌酸精简的L-谷氨酸高产菌株具有重大的应用价值。

发明内容

本发明提供了谷氨酸棒杆菌中敲除谷氨酸棒杆菌基因组上分支菌酸酮酰基还原酶基因cmrA得到突变菌谷氨酸棒杆菌△cmrA，谷氨酸棒杆菌△cmrA菌株在发酵培养基中，可以高效合成L-谷氨酸。

本发明提供一种谷氨酸棒杆菌，所述谷氨酸棒杆菌敲除了基因组上分支菌酸酮酰基还原酶基因cmrA。

在一种实施方式中，所述分支菌酸酮酰基还原酶基因cmrA具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC 13869。

本发明还提供了分支菌酸酮酰基还原酶基因在提高谷氨酸棒杆菌细胞通透性，或提高氨基酸合成效率方面的应用。

在一种实施方式中，所述应用是敲除或沉默谷氨酸棒杆菌基因组中的分支菌酸酮酰基还原酶基因。

本发明还提供一种提高发酵产品产量的方法，所述方法是敲除谷氨酸棒杆菌基因组上分支菌酸酮酰基还原酶基因cmrA，所述分支菌酸酮酰基还原酶基因cmrA具有SEQ IDNO.1所示的核苷序列。

在一种实施方式中，所述发酵产品包括但不限于谷氨酸棒杆菌的代谢产物。

在一种实施方式中，所述发酵产品为氨基酸或有机酸；所述氨基酸包括但不限于：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸；所述有机酸包括但不限于：柠檬酸、丙酮酸、乳酸、葡萄糖酸、衣康酸或苹果酸。

本发明还提供所述重组谷氨酸棒杆菌在发酵培养基中合成L-谷氨酸的应用。

在一种实施方式中，所述方法是将所述谷氨酸棒杆菌接种在发酵培养基中，于25-35℃，有氧条件下培养至少48小时。

在一种实施方式中，所述方法是将所述谷氨酸棒杆菌接种在发酵培养基中，于25-35℃，150～250rpm培养48～72小时。