[发明专利]一种新型初级纤毛标记的转基因斑马鱼的构建方法及应用

说明书

本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种新型初级纤毛标记的转基因斑马鱼的构建方法及应用。为寻找和鉴定更加便捷和合适的初级纤毛定位的信号肽作为纤毛定位信号，本发明提供了一种新型的标记模式动物斑马鱼全部细胞初级纤毛的转基因动物Tg(β‑actin‑zNphp3N‑mCherry)，在AB遗传背景的斑马鱼基因组中经Tol2转座酶插入了β‑actin‑zNphp3N‑mCherry的DNA片段；转基因斑马鱼的全部细胞可以表达zNphp3N‑mCherry融合蛋白，且该融合蛋白定位于细胞的PC中。可用于实时活体检测初级纤毛和初级纤毛相关信号通路的研究，以及可用于初极纤毛相关药物筛选和评价的模式实验动物。

技术领域

本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种新型初级纤毛标记的转基因斑马鱼的构建方法及应用。

背景技术

初级纤毛(Primary Cilium，PC)是存在于大多数真核细胞表面，具有9+0微管结构，突出于细胞膜表面呈天线状的亚细胞区域。该特化的亚细胞区域在细胞感应微环境机械和化学信号发挥着重要的作用，是实现胞外信号整合和集中传导的枢纽。目前已经发现许多受体、支架、离子通道、适配器分子和效应酶均定位于PC中，在细胞增殖、分化和代谢中发挥关键作用。PC是由中心粒组织生成的特化亚细胞区域，在细胞非分裂期，中心体的母中心粒迁移到细胞表面并开始伸长，形成由9个双微管包裹在质膜内的轴索结构，即成熟的纤毛及其基体。纤毛形态结构的形成和维持由中心粒周围的多种调节因子和支架蛋白所调控，这是一个进化高度保守的过程。在遗传发育过程中，纤毛或相关蛋白的突变会导致多种综合症的发生，这些综合症统称为纤毛相关疾病。常见的纤毛缺陷相关遗传疾病有：原发性纤毛运动障碍，多囊性肾病，视网膜脱落症，脑畸形，颅面异常，先天性心脏病，糖尿病，多指畸形，肥胖等。此外，脊椎动物中包括Hedgehog(Hh)信号通路、WNT信号通路、PDGF信号通路在内的很多信号通路均是依赖于PC的实现信号调控的，这些信号通路在调节细胞的命运和胚胎发育，个体物质和能量代谢的稳态维持中均发挥着及其关键的作用。这些信号通路相关因子的PC定位异常均会导致通路活性的异常，而引起包括癌症在内的严重疾病的发生。因此PC的标记不仅对精细研究PC的结构、动力学模型和PC相关信号通路分子机制奠定了良好的基础，也为PC相关信号通路所致疾病的研究以及药物的筛选和评价提供了重要的方法、材料和筛选评价平台。

对于PC的研究目前主要的方式是采用生物材料固定后的免疫组化的方法，这种方法的缺陷在于不能对于细胞进行活体的观察，因此无法动态实时的监测纤毛的变化，而且材料的固定、染色涉及的方案复杂，步骤繁琐，因此在实际应用中有较大局限。实现活体PC标记可以有效解决上述的问题，实现PC的活体实时监测。构建PC标记的关键在于选择纤毛定位信号。可以在PC中定位的蛋白有很多种，有结构蛋白、信号蛋白、膜蛋白和转运蛋白，然而在这些蛋白中，并没有发现保守的PC定位信号。目前常用于PC标记的纤毛定位信号来自于Arl13b和5HT6，但它们的定位机制并没有规律，没有发现其特异性初级纤毛定位的信号肽段，所以在实际应用中，均采用蛋白全长融合荧光蛋白进行PC标记。尽管上述的方法确实可以实现对初级纤毛的标记，但是存在较大的缺陷：(1)这两个蛋白较大，因此对于融合的功能蛋白有一定的影响；(2)这两个蛋白过表达后，在标记初级纤毛的同时，普遍造成了对于初级纤毛结构和功能的影响。而这些影响对于精细研究初级纤毛中信号通路来说是存在致命隐患。因此，亟待寻找和鉴定更加便捷和合适的初级纤毛定位的信号肽作为纤毛定位信号。

发明内容

本发明的目的在于提供建立全身性细胞初级纤毛标记的转基因动物的方法，可用于实时活体检测初级纤毛和初级纤毛相关信号通路的研究，以及可用于初极纤毛相关药物筛选和评价的模式实验动物。

本发明提供了一种新型的标记模式动物斑马鱼全部细胞初级纤毛的转基因动物Tg(β-actin-zNphp3N-mCherry)，在AB遗传背景的斑马鱼基因组中经Tol2转座酶插入了β-actin-zNphp3N-mCherry的DNA片段；转基因斑马鱼的全部细胞可以表达zNphp3N-mCherry融合蛋白，且该融合蛋白定位于细胞的PC中。